藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤：（１）采样；（２）藏羚羊耳部皮肤组织原代培养；（３）传代与纯化；（４）细胞冻存；（５）细胞复苏。本发明专利技术通过建立原代培养、细胞传代、细胞冻存与复苏的方法，获得了高活力藏羚羊成纤维细胞系，为深入开展藏羚羊分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了研究材料与技术支持。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：　　（１）采样：从雌性成年藏羚羊个体的耳部取１ｃｍ２皮肤组织，并将其放入装有贮存液的离心管中；　　（２）藏羚羊耳部皮肤组织原代培养：将所述步骤（１）所得的藏羚羊耳部皮肤组织依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液浸洗、含有双抗的Ｄ／Ｆ１２培养液冲洗后，将样本组织块放入３５ｍｍ培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，３ｈ后翻转培养瓶，加入３～５ｍＬ　Ｄ／Ｆ１２培养液继续培养１０～１８天，得到生长至８０％～９０％汇合的原代细胞；　　（３）传代与纯化：将所述步骤（２）所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用磷酸盐缓冲液清洗，再用１～２ｍＬ含０．０５％胰蛋白酶和０．０１％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液Ａ；然后将所述消化液Ａ放入饱和湿度二氧化碳培养箱２～３ｍｉｎ，取出，加入与消化液Ａ等量的Ｄ／Ｆ１２培养液终止消化，得到消化液Ｂ；将所述消化液Ｂ经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物Ａ；用Ｄ／Ｆ１２培养液将所述细胞沉淀物Ａ传入另一个培养瓶中，在３７．５℃、含５％ＣＯ２的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养３～６天，得到生长至８０％～９０％汇合的皮肤成纤维细胞；　　（４）细胞冻存：将所述步骤（３）所得的皮肤成纤维细胞用１～２ｍＬ含０．０５％胰蛋白酶和０．０１％乙二胺四乙酸的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在４℃保存半小时，然后在－７０℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；　　（５）细胞复苏：将所述步骤（４）所得的冻存皮肤成纤维细胞放入３７℃水浴中融化，吸出细胞悬液，用９倍所述细胞悬液体积的Ｄ／Ｆ１２培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到细胞沉淀物Ｂ；用Ｄ／Ｆ１２培养液充分悬浮细胞沉淀物Ｂ，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新全，于鸿浩，郭志林，郭松长，曹俊虎，徐世晓，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：63[中国|青海]