一种干细胞培养液及注射液制造技术

一种干细胞培养液，是由如下原料组成的：复方氨基酸注射液10%、注射用水溶性维生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脉力A液68%；pH值为6.8‑7.0，渗透压为310 mOsm/kg。采用所述干细胞培养液培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清；将收集的培养上清经滤膜过滤，收集滤液，即为干细胞注射液。使用去细胞化的干细胞分泌因子进行静脉注射，有效避免了干细胞在伦理方面的争议；所述干细胞培养液，原料成分均属于临床级别，安全可靠，为干细胞生存环境提供营养，能有效促进干细胞分泌大量的细胞因子，保持干细胞活性，并且营养增补剂配方与干细胞分泌因子配合，能有效缓解机体亚健康状态，重现机体健康。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞培养液及注射液
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种间充质干细胞培养液及注射液。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymalstemcells）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。间充质干细胞培养过程中，会分泌干细胞因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子A（PDGF-A）、转化生长因子（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素（IL）、胰岛素样生长因子（IGF-Ⅱ）、巨噬细胞集落刺激因子（GSFs）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN）、神经生长因子（NGF）、以及细胞分泌的外泌体（Exosome）、载有功能性蛋白质、mRNA及microRNA（miRNA）等物质。包含RNA分子这种复合细胞因子在人体内能够促进细胞增殖、分化和再生，加强新陈代谢，防止细胞衰老；介导机体细胞信号传导、活化机体干细胞，促进新毛细血管形成，进行生理性修复；调节机体亚健康，提高机体免疫清除损伤、病变、衰老的细胞。有研究表明，使用干细胞分泌因子及Exosome与使用干细胞具有相同的作用。因此，在细胞治疗中不使用细胞而使用细胞分泌因子的去细胞化的概念，受到越来越多的关注和支持，干细胞分泌因子与干细胞相比，优势明显。细胞在体外的生长依赖于培养液，而干细胞直接将细胞因子分泌到培养液中，培养液的成分直接关系到细胞因子的临床使用。现阶段动物细胞的体外培养主要依赖于胎牛血清，这样细胞在体外才能较好的增殖生长。但由于胎牛血清成分复杂，使用含血清的培养基培养细胞存在潜在的细胞毒性作用、外源病毒和致病因子污染问题，使细胞培养的标准化和终产品纯化难度加大，异种血清的残留也易导致临床上的过敏反应。因此，无血清培养基的开发和应用势在必行。所谓无血清培养基，是指不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。世界卫生组织将机体无器质性病变，但是有一些功能改变的状态称为“第三状态”，我国称为“亚健康状态”。亚健康即指介于健康和疾病之间的一种生理功能低下的状态。临床药物大体都是用于治疗疾病的药物，没有针对亚健康群体的调节剂。针对病患，临床上常用一些营养增补剂，来调节机体代谢及免疫系统，例如：人血白蛋白，具有增加循环血容量、维持血浆胶体渗透压的作用，可作为氮源为组织提供营养，利于细胞新陈代谢，也可作为载体，输送不同的物质；水溶性维生素，具有增强免疫力，抗氧化提高新陈代谢的作用，还具有控制和预防癌症的作用；复方氨基酸，可参与蛋白质的合成和代谢，生成酶类、激素、抗体、结构蛋白，促进组织愈合，恢复正常生理功能；谷氨酰胺，是一种营养增补剂，为机体提供氮源，促进蛋白质的合成，改善机体营养代谢，调节血糖，并可增强免疫系统的功能以及抗氧化；微量元素注射液，属于肠外营养添加剂，维持机体内的生化反应正常进行；水解蛋白，可进入组织细胞，参与蛋白质合成代谢，获得正氮平衡，并生成酶类、激素、抗体、结构蛋白、促进组织生理功能恢复正常；勃脉力A液，是水、电解质的补充剂和碱化剂，可保持渗透压，保护细胞。这些临床药物已在临床使用多年，其安全性和有效性得到社会的认可。专利CN102920735A、专利CN1966080A，均提供了一种间充质干细胞注射液，但是其注射液成分含有活细胞，降低了临床使用的安全性和可控性，并且，培养间充质干细胞时使用了胎牛血清，引入外源蛋白，使用的风险性更大；专利CN1618981A提供了一种干细胞分泌因子制备方法，其干细胞经过基因修饰后变为永生细胞，由于基因修饰存在一定的潜在风险，且干细胞分泌因子经过分离纯化，过程繁杂，干细胞分泌因子不可避免会造成损失；专利CN102008507A提供了一种脐带间充质干细胞注射液，但是其仅加入人血白蛋白和肝素钙，配方营养结构单一，对细胞活性及分泌因子含量会有一定影响，并且其注射液中含有活的干细胞，安全性也存在问题；专利CN102703385A提供了一种间充质干细胞培养液，其应用细胞培养液添加无血清添加剂、bFGF、EGF、胎球蛋白和抗生素制成干细胞培养液，首先细胞培养液不属于临床级试剂，不能直接应用于人体，其次，培养液中加入抗生素，存在过敏的风险，最后，其营养结构单一，不能满足细胞营养，可能对细胞活性及分泌因子含量有一定影响。不论是干细胞临床研究和治疗，还是对干细胞分泌因子的应用开发，均需要大量扩增间充质干细胞，因此，如何获得大量的间充质干细胞是研究的前提和关键。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种干细胞培养液及注射液。该注射液直接进行静脉注射，不含活细胞。操作过程简单可靠，应用安全，能有效提高机体免疫力，恢复健康状态。为实现上述目的，本专利技术提供一种干细胞培养液，其原料按体积百分比计算，由如下成分组成：复方氨基酸注射液10%、注射用水溶性维生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脉力A液68%。采用所述干细胞培养液培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清；将收集的培养上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为间充质干细胞注射液。所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或牙髓间充质干细胞等成体干细胞。为了实现上述目的，本专利技术还提供一种干细胞培养液的配制方法，包括如下步骤。步骤1、取1%的勃脉力A液，溶解注射用水溶性维生素，得混合液。步骤2、分别将步骤1的混合液、复方氨基酸注射液、丙氨酰谷氨酰胺、人血白蛋白、水解蛋白注射液、微量元素注射液、67%的勃脉力A液，按比例混匀，即为干细胞培养液。所述干细胞培养液pH值为6.8-7.0，渗透压为310mOsm/kg。为了实现上述目的，本专利技术还提供一种间充质干细胞注射液的制备方法，包括以下步骤。步骤1、间充质干细胞样本采集、处理。步骤2、干细胞的原代提取及培养：用物理剪切的方法分离间充质的组织，以组织块贴壁培养法采用无血清培养基培养间充质干细胞；离心分离单个核细胞，以贴壁培养的方式分离培养间充质干细胞。步骤3、干细胞的传代培养：当细胞达到70%以上融合时，清洗两次后加入细胞消化液，过滤去除组织小块，离心弃上清后，获得原代间充质干细胞；原代间充质干细胞用无血清培养基重悬后，接种在培养瓶或培养皿内，待细胞融合度达到80%-90%时，收集第一代间充质干细胞，作为种子细胞或继续传代培养。步骤4、间充质干细胞的生物学及流式细胞鉴定。步骤5、配制干细胞培养液，对间充质干细胞换液，继续培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清。步骤6、将步骤5中收集的干细胞培养上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为干细胞注射液。所述步骤1中样本处理采用酒精浸泡时间1-4min，所述酒精经0.22μm孔径滤膜过滤除菌。所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞培养液，其特征在于，包括以下原料：复方胺基酸注射液10%、注射用水溶性维生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脉力A液68%；pH值为6.8‑7.0，渗透压为310。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞培养液，其特征在于，包括以下原料：复方胺基酸注射液10%、注射用水溶性维生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脉力A液68%；pH值为6.8-7.0，渗透压为310。2.如权利要求1所述的干细胞培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、取勃脉力A液，溶解于注射用水溶性维生素，得混合液；步骤2、分别将步骤1的混合液、复方氨基酸注射液、丙氨酰谷氨酰胺、人血白蛋白、水解蛋白注射液、微量元素注射液、勃脉力A液，按比例混匀，即为干细胞培养液。3.一种干细胞注射液，其特征在于，采用所述干细胞培养液培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清；将收集的培养上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为干细胞注射液。4.如权利要求3所述的干细胞培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、间充质干细胞样本采集、处理；步骤2、干细胞的原代提取及培养：用物理剪切的方法分离间充质的组织，以组织块贴壁培养法培养间充质干细胞；用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，以贴壁培养的方式分离培养间充质干细胞；步骤3、干细胞的传代培养：当细胞达到60%以上融合时，清洗两次后加入细胞消化液，过滤去除组织小块，离心弃上清后，获得原代间充质干细胞；原代间充质干细胞用无血清培养基重悬后，接种在培养瓶或培养皿内，待细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳松，
申请(专利权)人：沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21