一种柞蚕微孢子虫模板DNA的提取方法及其在分子诊断方面的应用技术

本发明专利技术公开一种快速提取柞蚕微孢子虫模板DNA的方法及其应用，具体的所述模板提取的方法为，应用碱裂解结合磁珠进行DNA的释放、富集、分离与纯化，该方法操作简单快速、成本低、通量高、能活蛹取样、抗干扰能力强、污染风险低，提取的DNA品质高、可自动化，可以广泛应用于分子学诊断中，能显著提高检测通量、操作便利性，并显著降低检测假阳性率，提高检测灵敏度、准确度和检测效率；通过串联核酸自动提取仪和PCR仪、优选结果可视的PCR技术，能实现在多孔板上进行集批量DNA提取与分子诊断于一体的柞蚕微孢子虫可视化、自动化诊断技术。对柞蚕产业集中检疫柞蚕微粒子病和种质资源保护具有重要意义。

A method for extracting the template DNA of tussah microspore and its application in molecular diagnosis

The invention discloses a method for rapid extraction of n.antheraeae template DNA and its application, the method for the extraction of the template, and purified by alkaline lysis with magnetic beads. The release of DNA, enrichment and separation, the method has the advantages of simple operation, low cost, fast flux, high anti-interference ability can live pupae, sampling strong pollution, low risk, high quality, the extracted DNA can be automated, can be widely used in the molecular diagnosis, can significantly improve the detection flux, operation convenience, and significantly reduce the rate of false positive detection, improve the detection sensitivity, accuracy and efficiency of detection by series; nucleic acid extraction system and PCR instrument, optimization results PCR technology can be realized in the porous plate set batch DNA extraction and molecular diagnosis in one n.antheraeae visualization and automatic diagnosis technology. It is of great significance to the centralized quarantine of Antheraea pernyi particle disease and the protection of germplasm resources in the tussah industry.

【技术实现步骤摘要】
一种柞蚕微孢子虫模板DNA的提取方法及其在分子诊断方面的应用
本专利技术属于病原微生物的DNA提取方法及应用
，具体涉及一种快速获取柞蚕微孢子虫模板DNA的方法及其在分子诊断方面的应用。
技术介绍
柞蚕(Antheraeapernyi)起源于中国，是人类最宝贵的生物资源之一。我国是世界柞蚕业第一大国，产茧量占世界总产茧量的90％。目前我国柞蚕茧年产量8万吨以上，直接产值25亿元，蚕茧加工及综合利用产值180多亿元。柞蚕业已成为我国山区农村难以替代的主导优势产业。然而，自柞蚕产业形成规模之后，柞蚕微粒子病一直困扰着柞蚕业的发展，该病害的主要特点是危害时间长，资源浪费严重，分布广泛，传染途径复杂，该病害一旦爆发会造成重大经济损失，因此被列为柞蚕生产上重要的检疫性病害。柞蚕微粒子病是由柞蚕微孢子虫(Nosemapernyi,Np)寄生柞蚕所引起，主要通过胚种和食下进行传染。由于柞蚕野外放养的产业特点，杜绝胚种传播成为防治微粒子病的主要途径。目前，生产上普遍使用光学显微镜检查法(镜检，Microscopy)在制种过程中对雌蛾进行筛查，通过淘汰病蛾及其卵来切断微孢子虫的传播。该法简单易学、实用性强。但该法对制种人员的经验依赖性较高，检测结果的灵敏度和准确性差异较大。而且，微孢子虫的发育大致可分为孢原质期(Sporoplasmodium)、裂殖期(Merogony)、产孢期(Sporogony)以及成熟孢子期(Spore)四个阶段，而镜检主要针对成熟的微孢子虫，必然会存在漏检的情况，对于有效控制微粒子病害的作用有限。同时，镜检费时、费力，易诱发检测人员眼部疾病。在现有技术中，王伯阳等人公开了一种利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体的方法，建立了胶体金免疫层析检测法，但是该法灵敏度偏低，当柞蚕微孢子虫浓度低于8000个/μL时，该检测试纸条显色较浅或不显色，结果不稳定，无法进行准确判定。随后，姜义仁等人建立了柞蚕微孢子虫间接竞争酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法，将检测灵敏度提高到160个/μL，但其操作非常繁琐，配合生产难度大。分子诊断技术通过特异性扩增靶标基因达到诊断目的，灵敏度高，特异性好，广泛应用于病原微生物的检测。分子诊断中的关键技术涉及靶标DNA的提取、靶标基因的扩增引物、结果的快速、准确读出等。柞蚕微孢子虫具有一层几丁质外壳，导致其DNA释放困难，目前公开的的组织裂解液在从柞蚕中取样进行裂解的时候，通常伴有液氮研磨操作以破坏微孢子虫壁，达到良好的提取效果，但是液氮研磨费时、费力、污染风险高。因此，快速、简便的靶标DNA提取技术成为柞蚕微孢子虫分子诊断中的研究重点和难点。截至目前，仅邓真华等人公开了一种柞蚕微孢子虫的PCR诊断技术，该技术检测柞蚕微孢子虫灵敏度高，特异性好，检测下限低(每个反应体系中含有柞蚕微孢子虫基因组DNA0.94ng)。但是，该技术存在DNA提取过程繁琐、耗时、干扰因素多、通量低等问题。该法采用斑迹抽提液加入蛋白酶K于55℃消化4h后，用酚氯仿抽提得到模板DNA，相比以往公开的发芽处理、SDS法、TEK法，CTAB法有进步，无需研磨和调节PH值等繁琐操作，但是加热消化过程，容易造成蒸汽污染，同时时间较长(一般需要3～5h)，酚氯仿抽提对环境污染大，抽提需要辅助离心操作通量低。同时，该公开技术的研究主体是纯化后的柞蚕微孢子虫，而实际从柞蚕体内采样，极易受到黑化、蚕尿和蚕卵表面胶的干扰，不仅局限了取样操作，同时也影响了蛋白酶K的消化效果，所提DNA品质也会大打折扣，严重影响PCR诊断结果的准确性。因此，现行DNA提取方法存在的问题，如操作繁琐费时、通量低、交叉污染风险高(普遍需要加热操作、研磨、多步操作换管等引进污染)、提取过程制约因素多(黑化、尿液、卵胶干扰等)等，大大制约了柞蚕微孢子虫分子诊断技术的检测通量、灵敏度、便利性，成为应用分子诊断技术进行柞蚕微粒子病防疫的瓶颈问题。考虑到现行DNA分离纯化技术主要有酚氯仿抽提法，硅胶膜柱吸附法和磁珠分离法。酚氯仿抽提和硅胶膜柱吸附法都需要多次离心操作，对提取通量制约严重，磁珠分离法以可以特异性结合核酸的磁珠为载体，利用外加磁场进行核酸和杂蛋白的分离，无需离心操作，通量高，已经广泛应用于核酸自动提取仪设备的开发及生物医药，农林牧渔等研究领域，但是应用到柞蚕微孢子虫的检测领域尚未见公开。
技术实现思路
本专利技术针对现行柞蚕微孢子虫检测技术操作繁琐、通量低、检测灵敏度不高等
技术介绍
中列举的各种问题，提供了一种柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法及其试剂盒，并公开了其在分子诊断方面的应用。具体的，所述柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法所采用的技术方案是：用碱溶液对待测样本进行裂解处理，用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化；本专利技术中涉及的待测样本的来源与采集方法显著区别于现有技术，具体为：所述柞蚕微孢子虫的样本可以来源于柞蚕的任一时期的任何身体部位或者通过人工纯化、培养得到。从柞蚕上采集样品的时期可以是卵期、蚕期、蛹期和蛾期，采集样品的部位可以是组织、表皮、血液等。人工纯化培养的柞蚕微孢子虫可以是其细胞培养液、有缓冲溶液的悬浮液等。并可以实现活体取样。在优选的情况下，上文所述的技术方案，所述碱为无机碱，例如可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等，所述碱溶液的浓度可以是0.05～1M，处理过程通常伴有震荡、混匀操作，处理时间为1分钟～40天。在优选的情况下，上文所述的技术方案，所述裂解处理过程可以同时在碱液中加入十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)，浓度低于10％。处理时间1min～120h，处理温度为0-40℃。在优选的情况下，上文所述的技术方案，所述裂解处理过程可以是在加入碱液后可在-20～-16℃条件下进行冻融，冻融次数可以是1次或者多次，单次冷冻时间为10分钟～40天。具体的，对于上文所述的技术方案中，所述的磁珠作为分离载体在生物分离中有广泛的应用，在磁分离过程中，将磁性微球直接放入含有目标物的混合溶液中，目标物与磁性微球紧密结合，然后利用外部磁场进行分离。具体应用于本专利技术的磁珠为含有二氧化硅和四氧化三铁成分的磁性微球，例如SiO2@Fe3O4，C@SiO2@Fe3O4等。具体的，上文所述的技术方案中，所述DNA富集的过程，是将磁珠或者磁珠的悬浮液加入所述裂解液中，混匀，静置片刻。同时在裂解液中加入无水乙醇能提高富集效率，无水乙醇与裂解液的体积比例通常为0.7～1:1。具体的，上文所述的技术方案中，所述DNA的分离过程，是指通过外加磁场将磁珠与液相分离并丢弃液相。所述外加磁场通常使用磁铁。具体的，上文技术方案中所述的DNA纯化过程，通常用70-75％的酒精对已经富集DNA的磁珠进行清洗，清洗后通常伴有干燥、洗脱步骤，洗脱通常采用ddH2O、TE缓冲液或PCR反应液。此外，上文技术方案中所述的DNA纯化过程，当样本量十分低的情况下，可以直接使用PCR反应体系进行模板DNA的洗脱。例如，在后续采取常规PCR诊断时，配置反应体系，每25μL的反应体系含如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物(10pM)各0.5μL、rTaq0.25μL，10×Buffer2.5μL，dNTPsmix2μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其特征在于：用碱溶液对待测样本进行裂解处理，用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化。

【技术特征摘要】
1.一种柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其特征在于：用碱溶液对待测样本进行裂解处理，用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化。2.根据权利要求1所述的柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其特征在于：所述碱为无机碱；碱溶液的浓度是0.05～1M；所述碱液中还含有浓度低于10％的十二烷基硫酸钠。3.根据权利要求1所述的柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其特征在于：所述裂解处理过程的处理时间为1分钟～40天；处理温度为-20-40℃；所述处理过程还包含零到多次的冻融过程，单次冷冻时间为10分钟～40天。4.根据权利要求1所述的柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其特征在于：在用磁珠进行DNA的富集、分离与纯化的过程中，将磁性微球直接放入含有待测样本的混合溶液中，然后利用外部磁场进行分离，分离后采用ddH2O、TE缓冲液或PCR反应液洗脱。5.根据权利要求1所述的柞蚕微孢子虫模板DNA的获取方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佩佩，范琦，米锐，岳冬梅，赵振军，叶博，王林美，张波，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21