包含细小病毒病毒体的组合物中的DNA杂质制造技术

本发明专利技术涉及包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质。特别地，本发明专利技术显示DNA杂质不是随机包封在细小病毒病毒体内。本发明专利技术因此涉及用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法。最后，本发明专利技术涉及确定包含细小病毒载体的组合物是否被视为临床上纯的方法。

DNA impurity in a composition comprising a parvovirus virion

The present invention relates to nucleic acid impurities in a composition comprising a parvovirus vector. In particular, the present invention shows that DNA impurities are not randomly encapsulated in parvovirus viruses. The present invention thus relates to methods for identifying and quantification of nucleic acid impurities in a composition comprising a parvovirus vector. Finally, the present invention relates to determining whether a composition comprising a parvovirus vector is considered a clinically pure method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含细小病毒病毒体的组合物中的DNA杂质
本专利技术涉及病毒学和基因治疗领域。特别地，本专利技术涉及用于鉴定和/或定量组合物中过多出现的核酸杂质的方法。
技术介绍
基于腺相关病毒(AAV)的重组载体已用于许多临床试验中，并且对人类基因治疗有很大的希望。负责rAAV广泛成功的原则特征是其建立持续转基因表达与良好安全特征组合的能力。临床级rAAV的制备尤其集中于将DNA杂质最小化，所述DNA杂质潜在地可能编码有损载体安全性的致癌基因、抗生素标记物或免疫原性肽(Wright等人，2008,GeneTher.15,840-848)。虽然rAAV的上游和下游加工两者均已取得了巨大的进步，以确保最终产品的纯度，但完全消除不需要的DNA似乎并不可行。细胞或辅助载体DNA的包装看起来是AAV生物学的副产物，并且像这样固有地与预期转基因DNA的包壳联系。一旦无关DNA被包壳到预先形成的衣壳中，粒子就变得与仅含有预期表达盒的衣壳无法区分，并且实际上不可能分离它们。因此，为了支持临床开发并理解与rAAV载体中不需要的DNA存在相关的风险，需要在反映所使用的rAAV的生物分布谱的一系列细胞系中评估来自这些遗传元件的蛋白质表达的潜力，以排除非有意的蛋白质表达的理论可能性，可以导致不良效应，例如潜在有损载体安全性和/或功效的细胞重排、致肿瘤性或不需要的免疫应答。迄今为止，文献中已报道了污染rAAV制剂的DNA杂质的存在和浓度(Blouin等人，2004,J.GeneMed.6Suppl1,S223-S228；Nony等人，2003,J.Virol.77,776-781；Chadeuf等人，2005,Mol.Ther.12,744-753；Wright等人，2008，同上)。这些杂质的身份追溯到辅助质粒或宿主细胞DNA(Wright等人，2008，同上)。仅有限数目的研究解决了源自这种共包装的残留DNA的推定蛋白质表达的问题。Wright和同事在用rAAV感染人肝细胞或小鼠后通过RT-qPCR分析了cap、amp(r)和两个腺病毒基因E2A和E4的表达，并且未发现可检测的转录(Hauck等人，2009,MolTher.17(1)144-152)。相反，Miller等人已使用互补测定发现了DNA杂质驱动cap基因的表达(Halbert等人，2011,GeneTher.18(4):411-417)。用于分析生物制药学病毒体制剂中的DNA杂质的目前选择方法是qPCR。使用该方法确定特定DNA杂质的存在和量。重要的是，本领域技术人员因此预先地选择待检测的DNA杂质，即在进行qPCR之前，因为本领域普遍认为DNA杂质被随机地包装到病毒体内。这种(预选择的)DNA杂质可以例如包含宿主细胞DNA、Rep、Cap或质粒核苷酸序列。例如，如由Thorne等人(2009，Hum.GeneTher20：707-714)所示，使用两个靶监测宿主细胞DNA杂质：作为基于HeLa的生产系统的安全性评估的相关序列的人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7转化基因，以及作为敏感的一般标记物的核糖体RNA(rRNA)的高度表达的高拷贝基因。根据Thorne等人(同上)，最流行的共包装的序列衍生自包装质粒，包括AAVrep和cap以及细菌和哺乳动物细胞选择标记物基因。此外，Ye等人(2011，GeneTher.18,135-144)公开了来自HSV包装质粒的DNA序列在哺乳动物细胞系中的rAAV生产期间随机包装。根据Ye等人，AAV病毒体包含来自整个HSV基因组的随机片段。另外，Chadeuf等人(同上)显示在较小的DNA质粒的情况下，完整的质粒和病毒ITR被包封到病毒体内，包括选择标记物基因。因此，看起来无需检测特定的核苷酸序列，因为DNA杂质似乎被随机包装到细小病毒病毒体内。与将DNA杂质随机包装到病毒体内的一般教导相反，本专利技术显示一些DNA杂质实际上是过多出现的。因此，目前使用的用于检测生物制药学组合物中的DNA杂质的方法可以导致组合物中存在的DNA杂质的严重低估。药物组合物中的DNA杂质的这种低估可以导致施用临床上不够纯的组合物，导致对于患者潜在的安全健康风险。因此，在本领域中需要用于鉴定和定量生物组合物例如生物制药学制剂中过多出现的DNA杂质的手段和方法。本专利技术的目的是提供这种手段和方法。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术涉及用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中过多出现的核酸杂质的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：a)对组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段；b)将来自步骤a)的随机读段与用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质；c)确定每细小病毒载体的平均读段数目；和d)确定过多出现的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当读段分布不是随机的，并且过多出现的杂质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0或10％时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质。在一个优选实施方案中，步骤(a)中的核酸测序包括高通量测序。在一个优选实施方案中，细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一个优选实施方案中，生物组分的核苷酸序列选自以下的核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列，其中优选地，载体是杆状病毒载体。在一个优选实施方案中，辅助病毒是重组腺病毒和/或重组单纯疱疹病毒。在一个优选实施方案中，生物组分的核苷酸序列包含编码Rep、Cap和/或转基因的核苷酸序列，其中优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，其中更优选地，生物学组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因侧翼为至少一个细小病毒ITR，并且其中最优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。在一个优选实施方案中，过多出现的核酸杂质在第二组合物或进一步的组合物中进行定量。在第二个方面，本专利技术涉及用于定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法，其中所述方法包括确定核酸杂质的相对丰度的步骤，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，所述核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列1-8000bp、1-5000bp、1-3000bp、1-1000bp、1-500bp、1-250bp或1-100bp之间的核苷酸序列，并且其中所述生物组分包含侧翼为细小病毒ITR序列的至少一个拷贝的转基因。在一个优选实施方案中，生物组分选自由宿主细胞、质粒、除重组细小病毒载体外的载体和辅助病毒组成的组，其中优选地，载体是杆状病毒载体。在一个优选实施方案中，细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一个优选实施方案中，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，核酸杂质的核苷酸序列在细小病毒ITR序列的每一侧上紧邻定位。在一个优选的实施方案中，与细小病毒载体的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中过多出现的核酸杂质的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：a)对所述组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段；b)将来自步骤a)的随机读段与用于产生所述组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质；c)确定每细小病毒载体的平均读段数目；和d)确定过多出现的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当读段分布不是随机的并且过多出现的杂质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍所述生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0或10％时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.28 EP 14195464.41.一种用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中过多出现的核酸杂质的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：a)对所述组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段；b)将来自步骤a)的随机读段与用于产生所述组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质；c)确定每细小病毒载体的平均读段数目；和d)确定过多出现的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当读段分布不是随机的并且过多出现的杂质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍所述生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0或10％时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中的核酸测序包括高通量测序。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述生物组分的核苷酸序列选自以下核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体的核苷酸序列和辅助病毒的核苷酸序列，其中优选地，所述载体是杆状病毒载体。5.根据权利要求4的方法，其中所述辅助病毒是重组腺病毒和/或重组单纯疱疹病毒。6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述生物组分的核苷酸序列包含编码Rep、Cap和/或转基因的核苷酸序列，其中优选地，所述生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，其中更优选地，所述生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因侧翼为至少一个细小病毒ITR，并且其中最优选地，所述生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每一侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述过多出现的核酸杂质在第二组合物或进一步的组合物中进行定量。8.一种用于定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法，其中所述方法包括确定核酸杂质的相对丰度的步骤，当ITR序列在用于产生所述组合物的方法中使用的生物组分中存在时，所述核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列1-8000bp、1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·卢贝尔斯基，W·T·J·M·C·赫门斯，
申请(专利权)人：优尼科IP有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL