通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法技术

本发明专利技术涉及使用由靶材料调节的核酸聚合酶活性检测和量化生物材料的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物材料的方法，所述方法能够以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子材料、生物活性材料(酶活性)等，所述检测和量化根据特异性核酸是否特异性结合的DNA聚合酶的活性变化实现，所述特异性核酸与所制备的DNA适体形成复合物以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。本发明专利技术可提供用于检查生物材料的方法，所述方法能够无标记且灵敏地检测和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子材料、靶酶活性等，所述检测和量化通过由靶材料诱导的DNA适体的结构变化调节聚合酶的活性来实现。

Methods for detecting and quantifying biological materials by using the activity of a nucleic acid polymerase regulated by a target material

The invention relates to a method for adjusting the target material by use of nucleic acid polymerase activity detection and quantification of biological materials, and more particularly relates to a method for the detection or quantification of biological materials, the method with high sensitivity of detection and quantification of nucleic acid, protein and small molecular materials, bioactive materials (enzyme activity), change the activity of the detection and quantification of specific nucleic acid according to whether the specific binding of DNA polymerase, single stranded DNA the specific nucleic acid and the preparation of the DNA aptamer complex formation to include specific recognition of the specific nucleic acid. The present invention provides a method for inspection of biological materials, the method to label free and sensitive detection and quantification of target nucleic acid target, target protein, small molecule materials, target enzyme activity, the detection and quantification of changes in the structure of the aptamer regulating enzyme activity achieved by polymerization induced by target material DNA.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法
本专利技术涉及使用由靶分子控制的核酸聚合酶活性检测和量化生物分子的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物分子的方法，其可以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子物质、生理活性物质(酶活性)等，所述检测或量化以由特异性核酸的特异性结合引起的DNA聚合酶活性的变化为基础，所述特异性核酸与所制备的DNA适体(aptamer)形成复合物适体以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。
技术介绍
基于核酸的检测技术在疾病诊断、药物检测、环境监测和刑事调查中起重要的作用，且对于具有出色灵敏性和特异性并便于使用的新型检测技术存在持续的需求。已在现有技术中常规使用的基于核酸的检测技术基于为U形DNA探针的分子信标(molecularbeacon)，所述U形DNA探针用荧光团和淬灭剂标记。该技术包括确认荧光信号是否由分子信标的构象变化产生，所述分子信标的构象变化由靶核酸的存在导致(Tyagietal.,Naturebiotechnology,14:303-308,1996；Masukoetal.,NucleicAcidsResearch,26:5409-5416,1998)。由于该技术可迅速分析靶核酸而无需分离核酸，其被广泛使用，且已开发了多种类型的基于分子信标的核酸分析技术(Songetal.,AngewandteChemie-InternationalEdition,48:8670-8674,2009；Wuetal.,Biosensors&Bioelectronics,26:3870-3875,2011；Yehetal.,NanoLetters,10:3870-3875,2011)。然而，上述基于分子信标的分析技术具有的不足在于，由于靶核酸和分子信标以1:1的比率反应以生成荧光信号，难以实现较高的灵敏性。近年来，出于克服该问题并开发具有出色灵敏性的检测传感器的目的，已对使用酶作为工具用于信号放大做出了尝试。典型的实例包括其中酶以检测探针标记用于检测靶核酸的系统，且其中引入了抑制剂(Gianneschietal.,AngewandteChemie-InternationalEdition,46:3955-3958,2007；Saghatelianetal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety,125:344-345,2003；Pavlovetal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety,127:6522-6523,2005；Niemeyeretal.,AngewandteChemie-InternationalEdition,49:1200-1216,2010)。在该系统中，通过与检测探针的杂交，靶核酸的存在阻断抑制剂的抑制功能，且恢复的酶活性生成高荧光信号。然而，该技术具有的不足在于，其需要使用抑制剂标记酶的步骤，耗时长且需要很多技巧。此外，其不足还在于标记操作本身可能引起酶构象的变化从而降低酶的活性。此外，该技术具有的局限在于，其难以用作用于检测多种靶核酸的通用技术，这是由于其需要为每种靶核酸制备酶-抑制剂复合物。因此，需要开发无标记的基于酶的技术用于检测多种靶核酸。因此，本专利技术的专利技术人付出大量的努力以克服现有技术中存在的上述问题并建立了高度灵敏的基于酶的检测和量化系统，其无需使用抑制剂标记且其可普遍用于检测和量化多种靶核酸。结果是，本专利技术的专利技术人发现了使用包含特异性识别靶核酸的单链DNA的DNA适体以选择性和精确的方式实现了下述：(1)以关闭(switch-off)模式检测和量化靶核酸；(2)以开启(switch-on)模式检测和量化靶核酸；(3)以开启模式检测和量化靶分子；(4)以开启模式检测和量化靶BER酶的活性；和(5)以开启模式检测和量化靶核酸酶，由此完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的主要目的是提供使用DNA适体检测和量化靶核酸的方法，所述DNA适体包含特异性识别靶核酸的单链DNA。本专利技术的另一目的是提供使用适体检测和量化靶核酸的方法，所述适体包含与阻断剂核酸(blockernucleicacid)互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有与靶核酸互补的序列。本专利技术的另一目的是提供使用适体检测和量化靶分子的方法，所述适体包含与阻断剂DNA(blockerDNA)互补的单链DNA，所述阻断剂DNA特异性地识别靶分子且具有与靶分子结合的序列。本专利技术的另一目的是提供使用适体检测和量化靶BER(碱基切除修复(BaseExcisionRepair))酶活性的方法，所述适体包含与阻断剂核酸互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶BER(碱基切除修复)酶的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供使用适体检测和量化靶核酸酶活性的方法，所述适体包含与阻断剂核酸互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶核酸酶的核苷酸序列。技术方案为实现上述目的，本专利技术提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合，所述适体含有特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能(suppose)包含所述靶核酸，(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸(primerextension)反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。本专利技术还提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能(presume)包含所述靶核酸的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。本专利技术还提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶分子的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性识别并与结合所述靶分子的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶分子。本专利技术还提供使用由BER(碱基切除修复)酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶BER(碱基切除修复)酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶BER酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体‑靶核酸复合物结合，所述适体含有特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能包含所述靶核酸，(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.04 KR 10-2014-01524681.一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合，所述适体含有特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能包含所述靶核酸，(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。2.权利要求1的方法，其中所述适体的单链具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列。3.权利要求1的方法，其中当与所述靶核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。4.权利要求1的方法，其中所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQIDNO:21所示的保守区。5.权利要求1的方法，其中所述适体具有选自下组的核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:12。6.权利要求1的方法，其中所述靶核酸选自下组：A20-靶标、随机1-靶标、随机2-靶标、互补的脲-靶标1、非互补的衣原体-靶标1和互补的衣原体-靶标2。7.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶是TaqDNA聚合酶。8.权利要求1的方法，其中将步骤(a)的混合物在约90℃加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。9.权利要求1的方法，其中包含所述信号生成物质的混合物进一步包含模板核酸和TaqMan探针。10.权利要求1或9的方法，其中将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在约90°加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。11.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。12.权利要求1的方法，其中所述引物延伸反应在20-30℃的温度实施。13.权利要求1的方法，其中所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质。14.一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶核酸的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。15.权利要求14的方法，其中所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列。16.权利要求14的方法，其中当与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。17.权利要求14的方法，其中所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQIDNO:21所示的保守区。18.权利要求14的方法，其中所述适体具有SEQIDNO:14所示的核苷酸序列。19.权利要求14的方法，其中所述靶核酸为互补的脲-靶标2或非互补的衣原体-靶标2。20.权利要求14的方法，其中所述核酸聚合酶是TaqDNA聚合酶。21.权利要求14的方法，其中所述引物延伸反应在20-30℃的温度实施。22.权利要求14的方法，其中步骤(a)的混合物在约90℃加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。23.权利要求14的方法，其中包含所述信号生成物质的混合物进一步包含模板核酸和TaqMan探针。24.权利要求14或23的方法，其中将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在约90°加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。25.权利要求14的方法，其中所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质。26.权利要求14的方法，其中步骤(c)包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。27.权利要求14的方法，其中所述阻断剂核酸是阻断剂DNA或阻断剂RNA。28.权利要求14的方法，其中所述阻断剂核酸是具有SEQIDNO:15所示的核苷酸序列的脲特异性阻断剂。29.一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶分子的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性识别并结合所述靶分子的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶分子。30.权利要求29的方法，其中所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴铉圭，朴基洙，李昶烈，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR