犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用，所述犬细小病毒单域抗体具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，是以犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼，取外周血得到羊驼抗犬细小病毒血清；提取外周血中RNA，反转录生成cDNA；特异引物扩增纯化VHH片段；将VHH片段与噬菌粒载体连接并转化TG1，构建犬细小病毒单域抗体库；利用犬细小病毒结构蛋白VP2富集所述抗体库，导入表达菌株E.coilHB2151，IPTG诱导具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH表达。本发明专利技术制备的犬细小病毒单域抗体检测活性15?g/ml，检测灵敏度250ng/ml，可作为药物应用于犬细小病毒病犬的治疗中。

【技术实现步骤摘要】
犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于临床兽医及抗体工程
，涉及到一种病毒抗体，特别是涉及一种主要依托羊驼的重链抗体来实现其生物表达的犬细小病毒单域抗体，以及该抗体的制备方法和应用。
技术介绍
犬细小病毒病由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起，以发病率高、死亡率高、传染性强为特点，一年四季皆可发生，出血性肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病的死亡率分别为10%~50%、60%~100%，可造成严重经济损失。预防犬细小病毒病的疫苗主要有:灭活苗、弱毒苗和多联苗，优化的免疫程序可取得较好的免疫效果。但是对市场上疫苗的免疫效果进行检测调查研究发现，仅20%的疫苗能产生100%保护力的抗体。资料表明，我国宠物犬数量达1.5亿，随着宠物犬的数量增多，研究犬细小病毒病的诊断和防治具有重要意义。基于抗原与抗体特异性结合的诊断试剂盒，可检测抗原，也可检测抗体，敏感性高、特异性强、稳定性好、操作简便快速、结果易于分析判定。特异性的抗体对于诊断试剂盒的生产至关重要，目前常用抗体有单克隆抗体、多克隆抗体。在治疗方面，早期应用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等进行特异性治疗，可以取得较好的效果。但单克隆抗体规模化生产耗时长，抗血清规模化生产不能保证市场需求而且质量不稳定，而且单克隆抗体和抗血清的免疫原性强，在治疗过程中都存在副作用。因此，研究相关特异性强、亲和力高、免疫原性低、可规模化生产的抗体具有重要意义。普通抗体IgG(免疫球蛋白G)是血清中最重要的抗体，约占血清中免疫球蛋白总量的75%~80%，在体液免疫中起着“主力免疫”作用。IgG具有2条重链(H链)和2条轻链(L链)，整个抗体分子分为恒定区(C区)和可变区(V区)，分子量为150~160kDa。研究表明，羊驼血清中除了普通抗体IgG，有近一半的IgG为重链抗体，只具有重链可变区(VH)、一个铰链区和两个恒定区(CH2和CH3`)，而对重链抗体的可变区克隆构建只有一个重链可变区的抗体称为单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)，分子量仅为15kD，具有分子量小、结构单一、穿透性好、特异性强、亲和力高以及可溶性高、稳定性强、易克隆、高表达、易纯化等特点。因此，VHH可减少治疗过程中的副作用，可作为生物传感器诊断用靶标试剂，可用于构建免疫融合物、进行靶向治疗，可用于商品化大规模生产。目前，抗体在疾病的治疗方面仅限于细胞表面靶标，全抗体由于分子结构复杂，在细胞内表达困难，限制了其在细胞内的应用，VHH免疫原性低，很难激发T细胞的免疫反应，可以作为治疗性抗体而长期用药。总之，VHH作为一种小型化的基因工程抗体，独特的理化和生物学特性使其在基础研究、药物开发和疾病诊断治疗等领域具有广阔的应用前景。随着对基因表达的深入研究，抗体库的出现为抗体制备提供了一种新的手段，利用抗体库技术能够实现抗体的规模化制备，相关的噬菌体展示技术也是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术，其基本原理是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白的基因相连，插入到噬菌体的表达载体上，从而使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合表达并展示在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性；利用噬菌体在大肠杆菌系统易于分离扩增，可以通过与配体的结合选择出表达相应受体的噬菌体颗粒，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，可从中筛选出特异性抗体基因，并可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物学活性。这些技术在抗体工程中已有应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等特异性治疗制剂的缺陷，提供一种分子量小、免疫原性低、特异性强、稳定性强、易克隆表达的犬细小病毒单域抗体，以及该犬细小病毒单域抗体的制备方法和应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术利用噬菌体展示技术，从犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼的外周血中提取RNA，构建CPV-VHH犬细小病毒单域抗体库，并从抗体库中筛选获得具有生物活性的单域抗体。本专利技术的犬细小病毒单域抗体具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。本专利技术上述犬细小病毒单域抗体采用以下步骤进行制备:1)、提取经犬细小病毒免疫后羊驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA;特异引物扩增纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段；2)、犬细小病毒单域抗体VHH片段与噬菌粒载体连接构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库；3)、以犬细小病毒结构蛋白VP2加入活化的犬细小病毒噬菌体单域抗体库中，甘氨酸溶液竞争性洗脱，富集噬菌 粒重组载体导入感受态细胞疋HB2151菌株中，IPTG诱导产生具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH蛋白。更具体的，步骤1)中是分别以重链可变区特异引物CALL01/ CALL02和VHH特异引物VHH For2/VHH Rev2进行第一次和第二次PCR扩增，回收纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段。步骤2)中，是先以犬细小病毒单域抗体VHH片段与质粒载体PMD-18T simple连接构建质粒表达载体PMD-18T-VHH，转化大肠杆菌感受态DH5 α，回收纯化VHH，与噬菌粒载体构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库。其中，所述的噬菌粒载体为pCANTAB 5E，构建的噬菌体重组载体为pCANTAB5E-VHH。本专利技术获得的犬细小病毒单域抗体可以作为治疗药物，应用于犬细小病毒病犬的治疗中。本专利技术基于羊驼独特的重链抗体，利用抗体库技术、噬菌体表面展示技术，以犬细小病毒免疫羊驼、建立犬细小病毒单域抗体库，并从中获得了具有生物活性的犬细小病毒单域抗体，可实现抗体的规模化制备。羊驼血清中除了普通抗体IgG，有近一半的IgG为重链抗体。以皮下多点免疫法对两只健康成年羊驼进行犬细小病毒免疫，4个免疫周期后，抗血清效价高于1:64。试验表明，以饱和硫酸铵盐析法从羊驼抗犬细小病毒抗血清中初步分离IgG，通过蛋白G亲和层析可以分离纯化出IgGl和IgG3，分子量分别在90kDa和180kDa左右；未结合IgG通过蛋白A亲和层析可以分离出IgG2，分子量在75kD左右。纯化后的羊驼IgG各亚型SDS-PAGE电泳条带单一。本专利技术利用细胞形态学和噻唑蓝染色，试验观察本专利技术制备的羊驼抗犬细小病毒抗血清对F81细胞生长及增殖抑制率的影响，结果表明，羊驼抗犬细小病毒抗血清组、犬细小高免血清组细胞生长旺盛，紧密相连，细胞均质而透明；PBS组细胞数量减少、细胞游离、呈拉网状态。细胞增殖抑制率检测表明，羊驼抗犬细小病毒抗血清组、犬细小高免血清组、PBS组与病毒同时作用于F81细胞96h后，细胞增殖抑制率分别为3.9%, 6.2%, 80.8%。本专利技术制备的基于羊驼重链抗体表达的犬细小病毒单域抗体具有分子量小、结构单一、穿透性好、特异性强、亲和力高等特点。本专利技术利用五轮“吸附-洗脱-扩增”富集法，对噬菌体抗体库进行筛选富集，使噬菌体抗体库富集增长了近4000倍，阳性率达到92%。以ELISA检测犬细小病毒单域抗体的检测活性为15Pg本文档来自技高网...

【技术保护点】
犬细小病毒单域抗体，具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.犬细小病毒单域抗体，具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1犬细小病毒单域抗体的制备方法，采用以下步骤进行制备:1)、提取经犬细小病毒免疫后羊驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA;特异引物扩增纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段；2)、犬细小病毒单域抗体VHH片段与噬菌粒载体连接构建噬菌体重组载体，转化感受态大肠杆菌TG1，构建犬细小病毒噬菌体单域抗体库；3)、以犬细小病毒结构蛋白VP2加入活化的犬细小病毒噬菌体单域抗体库中，甘氨酸溶液竞争性洗脱，富集噬菌粒重组载体导入感受态细胞疋HB2151菌株中，IPTG诱导产生具有生物活性的犬细小病毒单域抗体VHH蛋白。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述步骤1)中，分别以重链可变区特异引物CALL01/...

【专利技术属性】
技术研发人员：段智变，孙耀贵，程志学，员世宇，詹俊杰，杨妍丽，李小茜，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：