【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、向患者提供低成本重组fviii蛋白的主要障碍是商业生产的高成本。fviii蛋白在异源表达系统中表达差，比类似大小的蛋白低2至3个数量级。(lynch等人,hum.gene.ther.；4:259–72(1993)。fviii的不良表达部分是由于在fviii编码序列中存在抑制fviii表达的顺式作用元件，如转录沉默元件(hoeben等人,blood 85:2447-2454(1995))、基质附着样序列(mar)(fallux等人,mol.cell.biol.16:4264-4272(1996))和转录延伸抑制元件(koeberl等人,hum.gene.ther.；6:469-479(1995))。
2、因此，本领域需要在异源系统中高效表达的fviii序列。
技术实现思路
1、公开了编码具有fviii活性的多肽的经密码子优化的核酸分子。
2、在某些方面，本文公开了包含与seq id no:9至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii(fviii)活性的多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:9至少90％相同。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq idno:9至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:9至少50％相同。
3、本文还公开了包含seq id no:9的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述
4、本文还公开了包含与seq id no:9的核苷酸58-4824至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含seq id no:9的核苷酸58-4824。
5、在某些方面，本文公开了包含与seq id no:33至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii(fviii)活性的多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:33至少90％相同。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq idno:33至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:33至少50％相同。
6、在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸分子还包含编码信号肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列包含seq id no:11的氨基酸序列。
7、在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸分子被密码子优化为含有与seq idno:32相比更少的cpg基序。在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸分子相对于seq idno:32缺失一个或多个cpg基序。
8、在另一方面，本文公开了包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:14至少85％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与seq id no:14至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与seq id no:14至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:14至少50％相同。
9、本文还公开了包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含seq id no:14的核苷酸序列。
10、在另一方面，本文公开了包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:35至少85％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与seq id no:35至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与seq id no:35至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与seq id no:35至少50％相同。
11、本文还公开了包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含seq id no:35的核苷酸序列。
12、在另一方面，本文公开了包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，所述基因盒包含：编码fviii蛋白的核苷酸序列，其包含与seq id no:9或seq id no:33至少85％相同的核酸序列；控制所述核苷酸序列转录的启动子和转录终止序列。
13、在一些实施方案中，启动子是肝特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mttr)启动子。在一些实施方案中，启动子是mttr482启动子。在一些实施方案中，启动子包含seq id no:16的核苷酸序列。
14、在一些实施方案中，转录终止序列是多腺苷酸化(polya)序列。在一些实施方案中，转录终止序列是牛生长激素多腺苷酸化(bghpa)信号序列。在一些实施方案中，转录终止序列包含seq id no:19的核苷酸序列。
15、在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含增强子元件。在一些实施方案中，增强子元件是a1mb2增强子元件。在一些实施方案中，a1mb2增强子元件包含seq id no:15的核苷酸序列。
16、在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是嵌合内含子、杂合内含子或合成内含子。在一些实施方案中，内含子序列包含seqid no:17的核苷酸序列。
17、在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含转录后调节元件。在一些实施方案中，转录后调节元件包含土拨鼠转录后调节元件(woodchuck posttranscriptionalregulatory element，wpre)。在一些实施方案中，wpre包含seq id no:18的核苷酸序列。
18、在另一方面，本文公开了分离的核酸分子，其包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒，位于基因盒两侧的第一反向末端重复序列(itr)和第二itr。在一些实施方案中，第一itr和/或第二itr衍生自病毒科细小病毒科的成员。在一些实施方案中，第一itr和/或第二itr衍生自人博卡病毒(hbov1)、人红病毒(b19)、鹅细小病毒(gpv)或其变体。在一些实施方案中，第一itr和/或第二itr包含与seq id no:1、2或21-30至少约75％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一itr包含与seq id no:1至少约75％相同的多核苷酸序列，并且第二itr包含与seq id no:2至少约75％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一itr包含与seq id no:1至少约50％相同的多核苷酸序列，并且第二itr包含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含与SEQ ID NO:9至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9至少90％相同。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
4.一种包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与SEQID NO:9的核苷酸58-4824至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO:9的核苷酸58-4824。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列还包含编码包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的信号肽的核酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列被密码子优化为含有相对于SEQ ID NO:32而言更少的CpG基序。
10.一种包含与SEQ ID NO:33至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33至少90％相同。
12.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
13.一种包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。
14.一种包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:14至少85％相同的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:14至少90％相同的核苷酸序列。
16.根据权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:14至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
17.一种包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
18.一种包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:35至少85％相同的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:35至少90％相同的核苷酸序列。
20.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:35至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
21.一种包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列。
22.一种包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒的分离的核酸分子，所述基因盒包含：
23.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是肝特异性启动子。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是mTTR482启动子。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含SEQ IDNO:16的核苷酸序列。
27.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)启动子。
28.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
29.根据权利要求18-2...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含与seq id no:9至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii(fviii)活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与seq id no:9至少90％相同。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与seq id no:9至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
4.一种包含seq id no:9的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii活性的多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与seqid no:9的核苷酸58-4824至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含seqid no:9的核苷酸58-4824。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列还包含编码信号肽的核酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列还包含编码包含seq id no:11的氨基酸序列的信号肽的核酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列被密码子优化为含有相对于seq id no:32而言更少的cpg基序。
10.一种包含与seq id no:33至少85％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii(fviii)活性的多肽。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与seq id no:33至少90％相同。
12.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与seq id no:33至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
13.一种包含seq id no:33的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有因子viii活性的多肽。
14.一种包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:14至少85％相同的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:14至少90％相同的核苷酸序列。
16.根据权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:14至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
17.一种包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含seq id no:14的核苷酸序列。
18.一种包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:35至少85％相同的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:35至少90％相同的核苷酸序列。
20.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与seq id no:35至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
21.一种包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含seq id no:35的核苷酸序列。
22.一种包含表达因子viii(fviii)多肽的基因盒的分离的核酸分子，所述基因盒包含：
23.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是肝特异性启动子。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mttr)启动子。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是mttr482启动子。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含seq idno:16的核苷酸序列。
27.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是人α-1-抗胰蛋白酶(a1at)启动子。
28.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含seq id no:36的核苷酸序列。
29.根据权利要求18-28中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述转录终止序列是多腺苷酸化(polya)序列。
30.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·马戈迪亚，刘童瑶，P·扎卡斯，
申请(专利权)人：比奥维拉迪维治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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