表达因子IX的慢病毒载体的用途制造技术

本公开文本提供了包含编码具有因子IX(FIX)活性的多肽的核酸序列的慢病毒载体及使用此类慢病毒载体的方法。本文公开的靶向肝的慢病毒载体可以用于基因疗法，其中所述慢病毒基因递送使得能够将转基因表达盒稳定整合到儿科(例如，新生儿)或成年受试者的所靶向细胞(例如，肝细胞)的基因组中，从而实现在低慢病毒载体剂量下FIX表达的改善。本公开文本还提供了治疗出血性障碍如血友病(例如，血友病B)的方法，所述方法包括向有需要的受试者以低剂量给予靶向肝的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码具有FIX活性序列的多肽的核酸序列。含编码具有FIX活性序列的多肽的核酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达因子IX的慢病毒载体的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年12月6日提交的美国临时专利申请序列号62/776,393的优先权，将所述申请的全部公开内容通过引用特此并入本文。
[0003]对电子提交的序列表的引用
[0004]以ASCII文本文件(名称：SA9
‑
468TW_SequenceListing_ST25；大小：28,470字节；以及创建日期：2019年12月2日)电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。

技术介绍

[0005]凝血途径部分地涉及因子VIIIa(FVIIIa)和因子IXa(FIXa)的酶复合物(Xase复合物)在血小板表面上的形成。FIXa是一种丝氨酸蛋白酶，其在没有其辅因子FVIIIa的情况下催化活性相对较弱。Xase复合物将因子X(FX)裂解为因子Xa(FXa)，所述因子Xa(FXa)转而与因子Va(FVa)相互作用以裂解凝血酶原并生成凝血酶。血友病B是一种出血性障碍，它是由FIX基因中导致FIX活性不足的突变和/或缺失引起的。
[0006]在血友病中，血液凝结受到缺乏某些血浆凝血因子的干扰。血友病B(也称为克里斯马斯病)是世界上最常见的遗传性出血性障碍之一。它是由因子IX的缺乏引起的，因子IX的缺乏可能是由于因子IX蛋白的合成减少或具有降低活性的缺陷分子导致的。它导致体内和体外血液凝结活性降低，并且在受影响个体的整个寿命期间需要进行广泛的医学监测。在没有有效预防的情况下，复发性关节积血(haemarthroses)导致进行性和致残性关节病的发展以及生活质量低下(Giangrande P.,Expert Opin Pharmacother.2005；6:1517
‑
24)。
[0007]血友病B的治疗通过用高度富集因子IX的外源因子浓缩物替代缺失的凝血因子来进行。然而，从血液中产生这种浓缩物充满了技术困难。因此，在本领域中需要一种克服当前替代疗法的困难和局限性的FIX疗法。通过将包含编码具有FIX活性的多肽的核酸序列的转基因表达盒稳定整合到所靶向细胞的基因组中，基因疗法成为持续治疗血友病B的潜在方法。

技术实现思路

[0008]本公开文本提供了预防或治疗有需要的受试者中血友病的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效剂量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码具有因子IX(FIX)活性的多肽的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体被包装在过表达CD47的HEK293T细胞中，所述慢病毒载体包含比未修饰的HEK293T细胞(CRL
‑
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TM
)中产生的对照慢病毒载体更高水平的表面CD47蛋白表达，并且其中相对于诱导与所述慢病毒载体相同的FIX活性所需的对照慢病毒载体的对照剂量，所述有效剂量降低。
[0009]在一些实施方案中，所述对照慢病毒载体在所述对照慢病毒载体的表面上包含19个分子/μm2的CD47。在一些实施方案中，所述慢病毒载体在所述慢病毒载体的表面上包含比在HEK293T细胞(CRL
‑
11268
TM
)中产生的对照慢病毒载体多至少约1.5倍、至少
约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍的CD47蛋白。
[0010]在一些实施方案中，所述有效剂量少于约5x10
10
转导单位/kg(TU/kg)、少于4x10
10
TU/kg、少于3x10
10
TU/kg、少于2x10
10
TU/kg、少于1x10
10
TU/kg、少于9x109TU/kg、少于8x109TU/kg、少于7x109TU/kg、少于6x109TU/kg、少于5x109TU/kg、少于4x109TU/kg、少于3x109TU/kg、少于2x109TU/kg、少于1x109TU/kg、少于约9x108TU/kg、或少于约8x108TU/kg。
[0011]在一些实施方案中，所述受试者在所述给予后展现出一种或多种以下特性：(a)相对于所述对照慢病毒载体，所述慢病毒载体的巨噬细胞转导减少；(b)相对于所述对照慢病毒载体，对所述慢病毒载体的同种特异性免疫应答降低；(c)在给予后至少3周，相对于正常FIX活性至少30％的FIX活性；(d)所述慢病毒载体在肝、脾或肝和脾二者中的组织特异性表达；和(e)(a)
‑
(d)的任何组合。
[0012]在一些实施方案中，所述同种特异性免疫应答包括响应于所述慢病毒载体的细胞因子的释放。在一些实施方案中，所述细胞因子选自MIP
‑
1a、MIP
‑
1b、MCP
‑
1及其任何组合。在一些实施方案中，相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MIP
‑
1a表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MIP
‑
1a表达。在一些实施方案中，相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MIP
‑
1b表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MIP
‑
1b表达。在一些实施方案中，相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MCP
‑
1表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MCP
‑
1表达。
[0013]在一些实施方案中，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后至少三周展现出相对于正常FIX活性至少约75％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约225％、至少约250％、至少约275％、或至少约300％的FIX活性。在一些实施方案中，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后至少三周展现出相对于正常FIX活性至少约150％的FIX活性。在一些实施方案中，相对于给予所述对照慢病毒载体的对照剂量的受试者，在给予所述慢病毒载体后24小时至48小时的血浆FIX活性增加。在一些实施方案中，相对于给予所述对照慢病毒载体的对照剂量的受试者，所述血浆FIX活性在所述给予后增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种预防或治疗有需要的受试者中血友病的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效剂量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码具有因子IX(FIX)活性的多肽的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体被包装在过表达CD47的HEK293T细胞中，所述慢病毒载体包含比未修饰的HEK293T细胞(CRL
‑
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TM
)中产生的对照慢病毒载体更高水平的表面CD47蛋白表达，并且其中相对于诱导与所述慢病毒载体相同的FIX活性所需的对照慢病毒载体的对照剂量，所述有效剂量降低。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照慢病毒载体在所述对照慢病毒载体的表面上包含19个分子/μm2的CD47。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述慢病毒载体在所述慢病毒载体的表面上包含比在HEK293T细胞(CRL
‑
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TM
)中产生的所述对照慢病毒载体多至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍的CD47蛋白。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述有效剂量少于约5x10
10
转导单位/kg(TU/kg)、少于4x10
10
TU/kg、少于3x10
10
TU/kg、少于2x10
10
TU/kg、少于1x10
10
TU/kg、少于9x109TU/kg、少于8x109TU/kg、少于7x109TU/kg、少于6x109TU/kg、少于5x109TU/kg、少于4x109TU/kg、少于3x109TU/kg、少于2x109TU/kg、少于1x109TU/kg、少于约9x108TU/kg、或少于约8x108TU/kg。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述给予后展现出一种或多种以下特性：(a)相对于所述对照慢病毒载体，所述慢病毒载体的巨噬细胞转导减少；(b)相对于所述对照慢病毒载体，对所述慢病毒载体的同种特异性免疫应答降低；(c)在给予后至少3周，相对于正常FIX活性至少30％的FIX活性；(d)所述慢病毒载体在肝、脾或肝和脾二者中的组织特异性表达；和(e)(a)
‑
(d)的任何组合。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述同种特异性免疫应答包括响应于所述慢病毒载体的细胞因子的释放。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子选自MIP
‑
1a、MIP
‑
1b、MCP
‑
1及其任何组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MIP
‑
1a表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MIP
‑
1a表达。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MIP
‑
1b表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MIP
‑
1b表达。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中相对于在给予所述对照慢病毒载体之后的MCP
‑
1表达，所述受试者在给予所述慢病毒载体之后展现出较低水平的MCP
‑
1表达。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者在给予所述慢病毒载体之后至少三周展现出相对于正常FIX活性至少约75％、至少约100％、至少约125％、至少约
150％、至少约175％、至少约200％、至少约225％、至少约250％、至少约275％、或至少约300％的FIX活性。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者在给予所述慢病毒载体之后至少三周展现出相对于正常FIX活性至少约150％的FIX活性。13.根据权利要求1至12所述的方法，其中相对于给予所述对照慢病毒载体的对照剂量的受试者，在给予所述慢病毒载体后24小时至48小时的血浆FIX活性增加。14.根据权利要求13所述的方法，其中相对于给予所述对照慢病毒载体的对照剂量的受试者，所述血浆FIX活性在所述给予后增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、或至少约200倍。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在给予所述慢病毒载体后，相对于所述受试者中除肝和脾之外的器官，所述受试者展现出所述慢病毒载体在肝、脾或肝和脾二者中增加的定位。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述增加的定位的特征在于，在给予所述慢病毒载体后，相对于所述受试者中除肝和脾之外的器官，在肝、脾或肝和脾二者中，所述慢病毒载体的载体拷贝数(VCN)高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、或至少约200倍。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述增加的定位的特征在于，在给予所述慢病毒载体后，相对于所述受试者中除肝和脾之外的器官，在肝、脾或肝和脾二者中，所述慢病毒载体的VCN高至少10倍。18.根据权利要求15至16中任一项所述的方法，其中所述增加的定位的特征在于，在给予所述慢病毒载体后，相对于所述受试者中除肝和脾之外的器官，在肝、脾或肝和脾二者中，所述慢病毒载体的VCN高至少50倍。19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述增加的定位的特征在于，在给予所述慢病毒载体后，相对于所述受试者中除肝和脾之外的器官，在肝、脾或肝和脾二者中，所述慢病毒载体的VCN高至少100倍。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述CD47是人CD47。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述人CD47包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列至少60％、至少约70％、至少70％、至少约80％、至少85％、至少约90％、至少95％、至少约96％、至少97％、至少约98％、至少99％、或约100％相同的氨基酸序列。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体不包含MHC
‑
I多肽。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是在与所述
HEK293T细胞(CRL
‑
11268
TM
)相比表达高浓度CD47的宿主细胞中产生的。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％序列同一性。25.一种预防或治疗有需要的受试者中血友病的方法，所述方法包括向所述受试者给予低于5x10
10
转导单位/kg(TU/kg)的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码具有因子IX(FIX)活性的多肽的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％序列同一性的核苷酸序列。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性。27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的核苷酸139
‑
1386具有至少85％序列同一性。33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述剂量为约5x10
10
TU/kg、约4.5x10
10
TU/kg、约4x10
10
TU/kg、约3.5x10
10
TU/kg、约3x10
10
TU/kg、约2.5x10
10
TU/kg、约2x10
10
TU/kg、约1.5x10
10
TU/kg、约1x10
10
TU/kg、约9.5x109TU/kg、约9x109TU/kg、约8.5x109TU/kg、约8x109TU/kg、约7.5x109TU/kg、约7x109TU/kg、约6.5x109TU/kg、约6x109TU/kg、约5.5x109TU/kg、约5x109TU/kg、约4.5x109TU/kg、约4x109TU/kg、约3.5x109TU/kg、约3x109TU/kg、约2.5x109TU/kg、约2x109TU/kg、约1.5x109TU/kg、约1x109TU/kg、约9.5x108TU/kg、约9x108TU/kg、约8.5x108TU/kg、约8x108TU/kg、约7.5x108TU/kg、约7x108TU/kg、约6.5x108TU/kg、约6x108TU/kg、约5.5x108TU/kg、约5x108TU/kg、约4.5x108TU/kg、约4x108TU/kg、约3.5x108TU/kg、约3x108TU/kg、约2.5x108TU/kg、约2x108TU/kg、约1.5x108TU/kg、或约1x108TU/kg。34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述剂量少于5x10
10
TU/kg、少于4.5x10
10
TU/kg、少于4x10
10
TU/kg、少于3.5x10
10
TU/kg、少于3x10
10
TU/kg、少于2.5x10
10
TU/kg、少于2x10
10
TU/kg、少于1.5x10
10
TU/kg、少于1x10
10
TU/kg、少于9.5x109TU/kg、少于9x109TU/kg、少于8.5x109TU/kg、少于8x109TU/kg、少于7.5x109TU/kg、少于7x109TU/kg、少于
ID NO:12所示的氨基酸序列。46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含组织特异性启动子。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述组织特异性启动子选择性地增强所述具有FIX活性的多肽在靶肝细胞中的表达。48.根据权利要求47所述的方法，其中选择性增强所述具有FIX活性的多肽在靶肝细胞中的表达的所述组织特异性启动子包括APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、mTTR启动子、MIR122启动子或其任何组合。49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述靶肝细胞是肝细胞。50.根据权利要求49所述的方法，其中将所述分离的核酸分子稳定地整合到所述肝细胞的基因组中。51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中慢病毒载体包含剪接供体位点。52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含剪接受体位点。53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含gag序列、pol序列、rev序列、rev反应元件(RRE)或其任何组合。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述gag序列是全长或截短的gag序列。55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含增强子、微小RNA的靶序列、转录后调控元件、包装信号、多聚A序列、内含子序列或其任何组合。56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体的剂量一次给予或分成至少两个亚剂量来给予。57.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体的剂量重复至少两次。58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中编码具有FIX活性的多肽的所述核苷酸序列还包含编码信号肽的核酸序列。59.根据权利要求58所述的方法，其中编码信号肽的所述核酸序列与以下各项具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性：(i)SEQ ID NO:2的核苷酸1
‑
84；(ii)SEQ ID NO:3的核苷酸1
‑
84；(iii)SEQ ID NO:4的核苷酸1
‑
84；(iv)SEQ ID NO:5的核苷酸1
‑
84；(v)SEQ ID NO:6的核苷酸1
‑
84；或(vi)SEQ ID NO:7的核苷酸1
‑
84。60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中编码具有FIX活性的多肽的所述核苷酸序列还包含编码前肽的核酸序列。61.根据权利要求60所述的方法，其中编码前肽的所述核酸序列与以下各项具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性：
(i)SEQ ID NO:2的核苷酸85
‑
138；(ii)SEQ ID NO:3的核苷酸85
‑
138；(iii)SEQ ID NO:4的核苷酸85
‑
138；(iv)S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彤瑶，S，
申请(专利权)人：比奥维拉迪维治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：