一种人诱导多能干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术公开一种人诱导多能干细胞库的构建方法，属于诱导多能干细胞的制备技术领域。本发明专利技术所述方法通过重编程皮肤成纤维细胞建立诱导多能干细胞，诱导多能干细胞的传代、冻存；建立诱导多能干细胞的数据库。本发明专利技术所述方法通能够在短时间内快速高效的将皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，避免了外源基因的加入，又能够保证细胞活力和增殖能力，传代稳定，并且高表达干细胞特异性蛋白，具有良好的多向分化能力，可长期存储。使用了无血清培养基以及血清替代物配制冻存液，避免非人源物质对细胞表面标记以及纯度的影响，对后期供者来源的干细胞以及干细胞制剂的使用提供安全无毒性的种子细胞。全无毒性的种子细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种人诱导多能干细胞库的构建方法


[0001]本专利技术涉及一种人诱导多能干细胞库的构建方法，属于诱导多能干细胞的制 备


技术介绍

[0002]诱导多能干细胞(Induce Pluripotent Stem Cells,iPSC)最初是日本科学家 Yamanaka于2006年利用病毒载体将4个转录因子OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和 c
‑
Myc)组合转入已经分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的 一种细胞类型；iPSC具有增值能力和多项分化能力，且由于其可来自供者的体 细胞，所以在临床应用时不会引起免疫排斥作用，又能够避开胚胎干细胞所带来 的医学伦理学问题，因此在疾病建模、药物发现以及细胞疗法等各方面都发挥重 要作用，促进了细胞生物学和再生医学等学科的发展。
[0003]但是目前诱导多能干细胞的重编程体系有很多，例如整合病毒载体转移系统 的重编程方法，但是一些报道指出，此方法由于外源基因的整合，病毒转基因的 重新激活及其在产生i PSCs中的残留活性会改变细胞的发育过程，并可能导致 嵌合动物肿瘤的形成，对于后期干细胞以及干细胞制剂有极大的限制。整合非病 毒性载体重编程效率极低，对于临床样本获取困难以及一些难治性疾病的样本的 要求极高，无法对少量的体细胞进行重编程。

技术实现思路

[0004]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术要解决的技术问题是：采用现有技术重编 程产生的诱导多能干细胞效率低下、转录因子整合影响细胞正常基因组及核型、 细胞活性差易自主分化，以及含有外源成分的问题。
[0005]本专利技术的目的在于提供一种重编程建立诱导多能干细胞的培养方法，通过制 备、纯化、扩增、鉴定与冻存过程，以更加安全、高效的方式完成对人诱导多能 干细胞库的构建；该方法能够在短时间内快速高效的将皮肤成纤维细胞重编程为 诱导多能干细胞，又能够保证细胞活力和增殖能力，传代稳定，并且高表达干细 胞特异性蛋白，具有良好的多向分化能力，可长期存储。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：一种人诱导多能干细胞库的构建方法，具体 包括以下步骤：
[0007](1)重编程皮肤成纤维细胞建立诱导多能干细胞，其中，重编程体系为非 整合型病毒体系，所选重编程病毒为仙台病毒，所含转录因子为c
‑
Myc，SeV， KOS，Klf4。
[0008](2)诱导多能干细胞的传代、冻存。
[0009](3)建立诱导多能干细胞的数据库：数据库中包括六项资料：细胞活性检 测结果、细胞感染的检测结果、遗传病的检测结果、细胞致癌性的检测结果、 HLA
‑
ABC/DR配型结果、细胞来源，并建立与冻存细胞的关联。
[0010]优选的，本专利技术所述重编程皮肤成纤维细胞建立诱导多能干细胞，具体包括 以下
步骤：
[0011]①
收集皮肤组织，将取得的皮肤组织采用酶消化贴壁的方法分离出成纤维细 胞，并对成纤维细胞进行传代、冻存以及进行相关鉴定；
[0012]②
在实施病毒转染的前两天，将冻存的第三代成纤维细胞接种在六孔板的至 少两个孔中，使转导当天的细胞密度达到每个孔2
×
105‑3×
105；
[0013]③
向预热的成纤维细胞培养基中加入非整合型病毒载体，将培养基加入成纤 维细胞中，之后细胞在条件为37℃，5％CO2的培养箱中孵育过夜；
[0014]④
病毒因子转入24h后，更换培养基以移去病毒，之后用成纤维细胞培养基 继续培养细胞6天，隔日换液；
[0015]⑤
第7天，用1ml稀释好的Geltrex Membrane Mtrix(Gibco)或Matrigel Matrix (Corning)37℃包被六孔板1h；
[0016]⑥
用0.5ml 0.05％
‑
0.25％EDTA胰蛋白酶消化离心收集细胞，并根据每孔5
ꢀ×
104‑
10
×
104密度将细胞接种在基质包被的六孔板上；加入成纤维细胞培养基， 37℃，5％的CO2培养箱中孵育过夜；
[0017]⑦
24小时之后，将成纤维培养基换更成Essential 8完全培养基，每天换液 一次；从第8天开始，每隔一天在显微镜下观察诱导多能干细胞克隆的出现；
[0018]⑧
通常在第12天观察到克隆形成，3
‑
4周后克隆长到合适的大小，手动挑选 未分化的干细胞克隆，记为第一代(P1)，并转移到采用Geltrex Membrane Mtrix (Gibco)包被的培养皿上以进一步扩增。
[0019]优选的，本专利技术所述成纤维细胞培养过程所用的培养基为：DMEM基础培 养基+10％胎牛血清+1％NEAA+1％双抗。
[0020]优选的，本专利技术所述诱导多能干细胞的传代的具体过程为：待细胞融合度达 到80％
‑
90％时，使用Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL)0.5ml，37℃ 消化5
‑
8min，显微镜下观察细胞克隆逐渐解离，细胞连接逐渐疏松，移去消化 液，加入0.5ml PBS轻轻清洗残余消化液后移去PBS，加入Essential 8完全培养 基，轻轻晃动培养皿，细胞克隆从培养皿底部脱落为5
‑
10个细胞团块的克隆， 将其转移到新的六孔板中，加入2ml Essential 8完全培养基继续培养。
[0021]优选的，本专利技术所述诱导多能干细胞的冻存的具体过程为：在传代细胞融合 度至80％
‑
90％时，使用Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL)0.5ml，37℃消 化5
‑
8min，显微镜下观察细胞克隆逐渐解离，细胞连接逐渐疏松，移去消化液， 加入0.5ml PBS轻轻清洗残余消化液后移去PBS，向其中加入1ml冻存液，冻存 液由KnockOutTM Serum Replacement(Gibco)+10％DMSO(Sigma)配成；轻轻晃动 培养皿，收集细胞于1.8ml冻存管中，放入程序性冻存盒(Corning)中，置于
‑
80℃ 冰箱内；24小时后，将细胞由
‑
80℃转移至液氮中保存。
[0022]优选的，本专利技术所述诱导多能干细胞培养过程使用的无血清培养基为 Essential 8
TM Medium(Gibco)或StemFlex TM Medium(Gibco)。
[0023]本专利技术所述所述成纤维细胞包括但不局限于人与哺乳动物来源的皮肤成纤 维细胞。
[0024]优选的，本专利技术所述人诱导多能干细胞数据库包括以下内容：
[0025](1)细胞活性检测：利用台盼蓝染色后计数，记录冻存细胞在冻存前后的 细胞数目，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
0.5ml，37℃消化5
‑
8min，显微镜下观察细胞克隆逐渐解离，细胞连接逐渐疏松，移去消化液，加入0.5ml PBS轻轻清洗残余消化液后移去PBS，向其中加入1ml冻存液，冻存液由KnockOutTM Serum ...

【专利技术属性】
技术研发人员：马隽，崔慧先，郭瑞云，冯宝峰，刘鑫，孔德胜，何晶晶，杜晓峰，刘博鑫，马振环，
申请(专利权)人：河北多能干细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：