用于制备病毒载体的组合物和方法技术

一种制备感染性重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用包含衣壳化缺陷型腺病毒(edAd)的第一病毒感染宿主细胞，所述edAd包含第一缺陷型病毒基因组；(b)将感染的宿主细胞在培养基中孵育足以产生感染性病毒颗粒的时间段；以及(c)回收分泌到培养上清液中的感染性病毒颗粒，其中所述edAd或所述宿主细胞包含经工程改造以表达感兴趣的靶基因的第二缺陷型病毒基因组，其中所述edAd或所述宿主细胞包含足以表达所述缺陷型病毒DNA复制所必须的腺病毒(Ad)辅助基因的核酸序列；并且其中所述edAd或所述宿主细胞包含核酸序列，所述核酸序列足以表达产生与所述第二病毒相对应的感染性复制缺陷型病毒颗粒所必须的辅助功能。染性复制缺陷型病毒颗粒所必须的辅助功能。染性复制缺陷型病毒颗粒所必须的辅助功能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备病毒载体的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2018年10月9日提交的美国临时申请号62/743,362的优先权，其全部内容通过引用合并于此。


[0003]本申请总体上涉及使用衣壳化缺陷型辅助病毒产生重组病毒载体的方法和组合物。

技术介绍

[0004]当前的重组病毒产生方法通常利用腺病毒辅助功能来制备重组病毒载体以有效地递送基因。常规方法通常采用转染方法，导致低于最佳病毒效价且难以扩大规模。当使用辅助腺病毒时，重组载体制剂被辅助病毒污染。
[0005]因此，需要提供更有效的方法来产生高效价的病毒制剂，所述制剂不被衣壳化的辅助病毒污染或没有其他不期望的作用。

技术实现思路

[0006]本申请的一个方面涉及用于产生重组病毒载体的衣壳化缺陷型腺病毒(edAd)。edAd在其基因组中包含一个或多个突变，其导致(1)一种或多种衣壳化必需蛋白的显著降低的产生或不产生，和/或(2)一种或多种缺陷型衣壳化必需蛋白的产生。
[0007]本申请的另一方面涉及用于产生本申请的edAd的包装细胞系。包装细胞能够产生一种或多种基因产物，其允许在包装细胞内的edAd的衣壳化。
[0008]本申请的另一方面涉及产生重组病毒(RV)的方法。所述方法包括以下步骤：(a)用一种或多种edAd感染生产细胞以产生感染的生产细胞，(b)在允许产生具有RV基因组的RV的条件下孵育感染的生产细胞；以及(c)收获所述重组病毒，其中所述edAd或所述生产细胞包含所述RV基因组。
[0009]本申请的另一方面涉及用于产生重组病毒的生产细胞。所述生产细胞包含(a)所述重组病毒的基因组，或(b)编码产生所述重组病毒所需的产物的基因，或(a)和(b)两者。
附图说明
[0010]图1A和1B描绘了腺病毒颗粒及其结构组分。图1C显示了腺病毒转录单元，包括由其编码的多肽。晚期单元编码蛋白，所述蛋白构成突变靶标以产生衣壳化缺陷型Ad(edAd)。
[0011]图2是描述与用包装感受态Ad(pcAd)或edAd感染宿主细胞相关的功能结果的示意图。具体而言，pcAd会产生感染性的包装好的腺病毒颗粒；而edAd则不会。
[0012]图3是描绘wt(分图A)和突变Ad(edAd，分图B
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E)基因组的示意图。分图B
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E中的突变Ad包括pIIIa缺失，这使它们衣壳化有缺陷。edAd
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dp3(分图B)具有野生型E1区，其允许在宿主细胞中进行DNA复制而无需E1a和E1b的表达。edAd
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1g和edAd
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2g(分图C和D)包括E1和
E3中的缺失，并且只能在表达E1a和E1b蛋白的细胞系(例如293细胞)中复制其DNA。edAd
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2g另外具有e4缺失，以进一步提高包装容量。edAd
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2g病毒能够在具有pIIIa表达的911E4细胞系中生长。edAd
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2g
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E1(分图E)在E3、E4和pIIIa中具有另外缺失，但具有野生型E1区。
[0013]图4是描绘分图A
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E中的几种不同的edAd的示意图，每种edAd均具有pIIIa缺失，使它们衣壳化有缺陷。此外，每种edAd均具有整合的AAV载体，用于产生表达期望靶基因的复制缺陷型AAV颗粒。AAV载体序列显示为替换Ad E3序列(分图A、B、D)或Ad E1序列(分图C、E)。分图C中的edAd1g
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AAV
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i1
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cre在Ad E3区插入CMV
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Cre表达单元，用于提供rAAV产生所必须的辅助基因功能的cre介导的激活。辅助基因功能的表达可通过cre介导的缺失或反转(inversion)终止序列而被激活。
[0014]图5是描绘了edAd的产生的示意图。在此，edAd中缺失的结构元件(例如pIIIa)由被稳定转化以反式表达缺失产物的宿主细胞提供。
[0015]图6是描绘在表达E1a和E1b辅助功能的宿主细胞(例如293细胞)中产生rAAV颗粒的常规三质粒转染方法的示意图。
[0016]图7是示意图，其描绘当以下情况时产生rAAV载体和pcAd或wt Ad：用含有具有AAV ITR的缺陷型AAV基因组(其经工程改造以表达期望靶基因)的质粒和共表达Rep和Cap(以为rAAV产生提供辅助功能)的质粒共转染宿主细胞，以及还用wt Ad或pcAd(其为rAAV产生提供辅助功能)感染相同的宿主细胞。还产生wtAd和pcAd的副产物。
[0017]图8是描绘通过用edAd感染宿主细胞来产生rAAV载体的示意图。在这种情况下，宿主细胞(HeLa)用AAV rep和cap表达质粒以及带有AAV ITR的缺陷型AAV基因组稳定地转化，所述缺陷型AAV基因组经工程改造以表达期望的靶基因。尽管将具有E1区的感染性edAd
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dp3施加于宿主细胞，但所得的rAAV不受腺病毒污染。
[0018]图9是描绘通过用edAd(例如图4的分图C中的edAd1g
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AAV
‑
i1
‑
Cre)感染293细胞(其被稳定转化以表达E1a、E1b和可诱导型Rep
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CapCap)来产生rAAV的示意图。在这种情况下，来自edAd的Cre的表达会切除构建入Rep表达单元中的内含子/聚A中的loxed片段，从而激活Rep表达。edAd还包含带有AAV ITR的缺陷型AAV基因组，所述基因组经工程改造以表达期望的靶基因。所得的rAAV不受Ad污染。Cre可以用其他表达诱导系统替代。
[0019]图10是描绘通过在Hela或A549宿主细胞中感染具有wt E1a/E1b区的edAd(edAd1g
‑
AAV
‑
E1)来产生rAAV的示意图。edAd还包含带有AAV ITR的缺陷型AAV基因组，所述基因组经工程改造以表达期望的靶基因。稳定转化Hela和A549宿主细胞以表达AAV Rep和Cap。所得的rAAV不受Ad污染。
[0020]图11是描绘在提供E1a/E1b、E2和E4辅助功能的293细胞中用具有E1a/E1b、E2、E3和E4缺失的edAd产生rAAV的示意图。具有cre基因的edAd2g
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AAV
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cre被设计用于去除构建入rep中的内含子中的loxed片段，从而激活rep表达。edAd2g
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AAV/(Cre)还包含带有AAV ITR的缺陷型AAV基因组，所述基因组经工程改造以表达期望的靶基因。所得的rAAV不受Ad污染。
[0021]图12是描绘产生第一代(分图A)、第二代(分图B)和第三代(分图C)慢病毒载体颗粒所必须的组分的示意图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生重组病毒的衣壳化缺陷型腺病毒(edAd)，所述edAd包含：具有一个或多个突变的edAd基因组，所述一个或多个突变导致(1)一种或多种衣壳化必需蛋白的显著降低的产生或不产生，和/或(2)一种或多种缺陷型衣壳化必需蛋白的产生。2.如权利要求1所述的edAd，其中所述一种或多种衣壳化必需蛋白选自由以下构成的组：衣壳蛋白IX、衣壳化蛋白IVa2、蛋白13.6、衣壳化蛋白52K、衣壳蛋白前体pIIIa、五邻体基底(衣壳蛋白III)、核心蛋白前体pVII、核心蛋白V、核心蛋白前体pX、衣壳蛋白前体pVI、六邻体(衣壳蛋白II)、蛋白酶、六邻体组装蛋白100K、蛋白33K、衣壳化蛋白22K、衣壳蛋白前体pVIII、蛋白UXP和纤维(衣壳蛋白IV)。3.如权利要求1所述的edAd，其中所述一个或多个突变包含导致衣壳蛋白前体pIIIa不表达的突变。4.如权利要求3所述的edAd，所述edAd进一步包含蛋白V、六邻体、Iva2、L1
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52/55k和/或L4
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22K中的一个或多个缺失。5.如权利要求3所述的edAd，所述edAd进一步包含纤维蛋白中的缺失。6.如权利要求1所述的edAd，其中所述一个或多个突变包含所述六邻体组装蛋白100K的缺失。7.如权利要求1所述的edAd，所述edAd进一步包含腺病毒早期基因中的一个或多个缺失。8.如权利要求7所述的edAd，所述edAd包含腺病毒早期基因E1中的缺失。9.如权利要求7所述的edAd，所述edAd包含腺病毒早期基因E1和E3中的缺失。10.如权利要求7所述的ed...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫东，余湘萍，
申请(专利权)人：耐克基因有限责任公司，
类型：发明
国别省市：