细小病毒载体及其制备方法和用途技术

一种重组细小病毒载体，所述重组细小病毒载体包含细小病毒衣壳和具有有义链和反义链的双链载体基因组。所述有义链以5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细小病毒载体及其制备方法和用途
[0001]本申请要求于2019年12月17日提交的美国临时申请号62/949,052的优先权。


[0002]本专利技术总体上涉及用于基因转移和基因疗法应用的载体。特别地，本申请涉及在重组病毒载体例如细小病毒载体的生产期间产生的不期望的反义RNA和双链RNA(dsRNA)的管理。

技术介绍

[0003]重组细小病毒，例如腺相关病毒(AAV)，已被广泛用作基因疗法领域中的基因转移载体。然而，重组细小病毒在复制期间通常会产生反义RNA或dsRNA，这会导致病毒生产产率降低。
[0004]因此，需要能够以高产率生产的新细小病毒载体。

技术实现思路

[0005]本申请描述了具有病毒基因组(具有反义RNA或dsRNA去稳定/破坏结构域(RDDD))的细小病毒载体，并且包括用于生产这样的载体的方法和DNA构建体。构建体、载体和方法适用于基因转移/疗法应用，包括需要递送重组基因表达盒的那些。
[0006]本申请的一个方面涉及细小病毒载体，所述细小病毒载体包含：细小病毒衣壳；以及包含有义链和反义链的双链载体基因组，其中所述有义链以5
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至3
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方向包含：5
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端处的细小病毒末端重复；目的基因(GOI)的编码序列；和3
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端处的细小病毒末端重复，其中所述载体基因组进一步包含RDDD。
[0007]在一些实施方式中，RDDD位于反义链中。在一些实施方式中，RDDD以反向取向位于GOI的内含子中。
[0008]在一些实施方式中，细小病毒载体是AAV载体。
[0009]在一些实施方式中，RDDD包含微小RMA。在一些实施方式中，RDDD包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3。在一些实施方式中，RDDD包含SEQ ID NO:1的两个或更多个拷贝和/或SEQ ID NO:3的两个或更多个拷贝。在一些实施方式中，RDDD包含选自由SEQ ID NO:2、4、5、6和7构成的组的核苷酸序列。
[0010]在一些实施方式中，RDDD包含核酶。在一些实施方式中，核酶包含SEQ ID NO:9。
[0011]在一些实施方式中，细小病毒载体进一步包含第二RDDD。在一些实施方式中，第二RDDD包含SEQ ID NO:8。
[0012]本申请的另一方面涉及提高重组细小病毒的生产产率的方法，所述方法包括以下步骤：将RNA去稳定/破坏结构域(RDDD)插入到重组细小病毒中。重组细小病毒包含：细小病毒衣壳；以及包含有义链和反义链的双链病毒基因组，其中所述有义链以5
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至3
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方向包含：5
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端处的细小病毒末端重复；目的基因(GOI)的编码序列；和3
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端处的细小病毒末端重复，其中所述RDDD插入到所述病毒基因组中。
[0013]在一些实施方式中，RDDD位于病毒基因组的反义链中。在一些实施方式中，RDDD以反向取向位于GOI的内含子中。
附图说明
[0014]图1显示了在目的基因(GOI)的反义取向上的隐蔽(cryptic)启动子，其驱动从GOI表达盒的反义链表达反义RNA，这会对GOI mRNA的表达和活性产生负面影响。
[0015]图2显示了细小病毒载体中的dsRNA形成机制。途径A显示了从重组细小病毒载体形成GOI mRNA，所述载体包含编码GOI完全转录单元的完整基因组，其在负链中可能没有反义转录。途径B显示了从含有重组细小病毒载体基因组的一部分的缺陷性(defective)干扰(DI)颗粒形成dsRNA。产生的dsRNA然后能够干扰GOI mRNA的表达和活性。
[0016]图3显示了控制或调节mRNA的表达或由其的翻译的RNAi、核酶和反义寡核苷酸。这些工具用于本申请的细小病毒载体中以调节由细小病毒载体形成的反义RNA和dsRNA。
[0017]图4显示了降低或消除反义RNA的负面影响的RNA去稳定/破坏结构域的实施方式。RDDD被放置于带有隐蔽启动子的GOI的反义链中3
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ITR或转录终止位点之前的区域中。反义RNA被RNA去稳定/破坏执行分子(RDDDEM)(右分图)去稳定或破坏，而GOI mRNA不受影响(左分图)。
[0018]图5描绘了示例性细小病毒载体，其包含RDDD以降低或消除可由细小病毒载体形成的dsRNA的影响。RDDD被放置于GOI的反义链的3
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ITR或转录终止位点之前。在这种情况下，从缺陷性干扰颗粒表达的dsRNA被RDDDEM(右分图)去稳定或破坏，而GOI mRNA不受影响(左分图)。RDDD的位置可以变化，只要其仅从DI颗粒(而不是全长载体)转录即可。
[0019]图6说明了使用自切割核酶来降低或消除反义RNA的影响的示例性策略。核酶被放置于带有隐蔽启动子的GOI的反义链中3
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ITR或转录终止位点之前的区域中。反义RNA被核酶去稳定或破坏(右分图)，而GOI mRNA不受影响(左分图)。
[0020]图7说明了使用自切割核酶来降低或消除dsRNA的影响的示例性策略。核酶被放置于GOI的反义链中3
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ITR或转录终止位点之前的区域中。从DI颗粒表达的dsRNA被核酶去稳定或破坏(右分图)，而GOI mRNA不受影响(左分图)。
[0021]图8说明了使用具有嵌入的RDDD的内含子来控制反义RNA的干扰。内含子放置于GOI链中。RDDD放置于内含子的反义链中。使用具有RDDD的内含子允许更灵活地放置RDDD。内含子可放置于任何基因内，前提条件是其中存在或引入了合适的剪接供体/受体位点。在分图A中，内含子在GOI起始密码子的5
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末端处、紧邻转录起始位点之后嵌入。在分图B中，内含子嵌入在GOI的编码区中。
[0022]图9说明了使用具有嵌入的RDDD的内含子来控制dsRNA的干扰。内含子在GOI链中。RDDD在内含子的反义链中。使用具有RDDD的内含子允许更灵活地放置RDDD。内含子可以放置在基因中与外显子边界共有序列匹配的任何位点。在分图A中，内含子在GOI起始密码子的5
’
末端处、紧邻转录起始位点之后嵌入。在分图B中，内含子嵌入在GOI的编码区中。
[0023]图10说明了通过在宿主细胞中表达RDDDEM来管理/控制反义RNA和dsRNA的三种不同途径。使用内源表达的RDDD，例如miRNA和siRNA，允许从载体中消除dsRNA和反义RNA。
[0024]图11说明了具有嵌入的聚A(polyA)序列的内含子的使用。可以使用多个聚A序列。内含子紧密邻近隐蔽启动子放置，以终止针对GOI的反义RNA的转录(右分图)，而GOI表达不
受影响，因为在RNA剪接期间去除了GOI中的一个或多个内含子。
[0025]图12描绘了通过掺入RDDD来降低或消除dsRNA的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细小病毒载体，所述细小病毒载体包含：细小病毒衣壳；以及包含有义链和反义链的双链载体基因组，其中所述有义链以5
’
至3
’
方向包含：5
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端处的细小病毒末端重复；目的基因(GOI)的编码序列；以及3
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端处的细小病毒末端重复，其中所述载体基因组进一步包含RNA去稳定/破坏结构域(RDDD)。2.如权利要求1所述的细小病毒载体，其中所述RDDD位于所述反义链中。3.如权利要求1所述的细小病毒载体，其中所述RDDD以反向取向位于所述GOI的内含子中。4.如权利要求1所述的细小病毒载体，其中所述细小病毒载体是AAV载体。5.如权利要求1
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4中任一项所述的细小病毒载体，其中所述RDDD包含微小RMA。6.如权利要求1至5中任一项所述的细小病毒载体，其中所述RDDD包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3。7.如权利要求1至6中任一项所述的细小病毒载体，其中所述RDDD包含SEQ ID NO:1的两个或更多个拷贝和/或SEQ ID NO:3的两个或更多个拷贝。8.如权利要求1至7中任一项所述的细小病毒载体，其中所述RDDD包含选自由SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫东，余湘萍，
申请(专利权)人：耐克基因有限责任公司，
类型：发明
国别省市：