用于治疗肌营养不良的肌肉特异性微小肌营养不良蛋白的腺相关病毒载体递送制造技术

本发明专利技术提供了表达微型化的人微小肌营养不良蛋白基因的基因治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及使用这些载体在包括隔膜肌和心肌在内的骨骼肌中表达微小肌营养不良蛋白以及使肌纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或预防患有肌营养不良的受试者的纤维化的方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗肌营养不良的肌肉特异性微小肌营养不良蛋白的腺相关病毒载体递送
[0001]本申请要求2018年6月18日提交的美国临时专利申请号 62/686,668号；2018年10月2日提交的美国临时专利申请号 62/740,402；2018年10月30日提交的美国临时专利申请号 62/752,841；2019年3月25日提交的美国临时专利申请号 62/823,649和2018年6月11日提交的美国临时专利申请号 62/860,220的优先权权益，这些临时专利申请中的每个以引用的方 式整体并入本文。
[0002]以引用的方式并入以电子方式提交的材料
[0003]作为本公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表， 该序列表以引用的方式整体并入本文并且标识如下：文件名： 53169_Seqlisting.txt；大小：60,056字节，创建日期：2019年6月17 日。


[0004]本专利技术提供了表达微型化的人微小肌营养不良蛋白基因的基因 治疗载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及使用这些载体在包 括隔膜肌和心肌在内的骨骼肌中表达微小肌营养不良蛋白以及使肌 纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或预防患有肌营养不良的 受试者的纤维化的方法。

技术介绍

[0005]肌肉质量和力量对于日常活动(诸如运动和呼吸)以及全身代 谢的重要性是显而易见的。肌肉功能不足会引起肌营养不良(MD) (所述肌营养不良的特征在于肌无力和消瘦)并且会严重影响生活 质量。最完善表征的MD是编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物 (DAPC)的成员的基因突变的结果。这些MD是DAPC引起的肌 膜细胞骨架栓系丧失相关的膜脆性的结果。杜兴肌营养不良(DMD) 是最致命的肌肉疾病之一，在5000名新生男孩中就有1名受其影响。
[0006]DMD是由DMD基因中的突变导致的，所述突变导mRNA的减 少和肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是一种与肌营养不良 蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kD肌膜蛋白(Hoffman等 人,Cell 51(6):919
‑
28,1987)。DAPC由肌肉肌膜处的多种蛋白质组 成，这些蛋白质经由肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和 α
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肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在胞外基质 (ECM)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接用于在收缩 过程中稳定肌肉细胞膜以及防止收缩引起的损伤。随着肌营养不良 蛋白的丧失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙内流，从而触发钙活化的蛋 白酶和分段性纤维坏死(Straub等人,Curr Opin.Neurol.10(2):168
‑ꢀ
75,1997)。肌肉退化和再生的这种不受控制的循环最终会耗尽肌肉 干细胞群(Sacco等人,Cell,2010.143(7):第1059
‑
71页；Wallace等 人,Annu Rev Physiol,2009.71:第37
‑
57页)，从而引起进行性肌无 力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕。
[0007]在不存在来自肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白的膜稳定 的情况下，DMD将
表现出组织损伤的不受控制的循环，并且通过结 缔组织增殖来进行纤维化瘢痕组织替代丧失的肌纤维的最终修复。 纤维化的特征在于ECM基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)的过 多沉积。ECM蛋白主要由细胞因子(诸如TGF)产生，所述细胞 因子由活化的成纤维细胞响应于应激和炎症而释放。虽然DMD的 主要病理特征是肌纤维退化和坏死，但是作为病理结果的纤维化具 有相同的后果。纤维化组织的过度产生限制了肌肉再生，并且导致 了DMD患者的进行性肌无力。在一项研究中，初始DMD肌肉活检 中纤维化的存在与10年随访的不良运动结局高度相关联(Desguerre 等人,J Neuropathol Exp Neurol,2009.68(7):第762
‑
7页)。这些结果 表明纤维化是导致DMD肌肉功能障碍的主要因素，并且强调了在 明显纤维化之前需要早期干预的必要性。
[0008]对于患有DMD的患者，需要增加肌肉力量以及防止肌肉损的 治疗。

技术实现思路

[0009]本专利技术涉及将微小肌营养不良蛋白基因表达至骨骼肌(包括隔 膜肌和心肌)，以使肌纤维免受损伤、增加肌肉力量以及减少和/或 预防纤维化的基因治疗载体，例如AAV。
[0010]本专利技术提供了用于使用基因治疗载体来递送微小肌营养不良蛋 白，以解决在DMD中观察到的基因缺陷，从而增加肌肉力量和/或 增加肌肉质量的疗法和方法。实施例2描述了针对杜兴肌营养不良 的全身性基因递送临床试验，在该研究中，受试者接受2
×
1014 vg/kg AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白。实施例3中描述的临 床研究提供了一种新型关键性临床方案，所述方案包括随机双盲安 慰剂对照设计。在研究开始时，受试者被随机分组并且接受2
×
10
14 vg/kg AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白或乳酸林格氏液。
[0011]本专利技术提供了包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列的核酸 分子。本专利技术还提供了包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO: 8的核苷酸1
‑
4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021的rAAV，以 及包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1
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4977 或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021的rAAV颗粒。
[0012]本专利技术的另一个方面提供了包含核酸分子、rAAV和rAAV颗粒 的组合物，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列， 所述rAAV包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷 酸1
‑
4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021，所述rAAV颗粒包含 SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1
‑
4977或SEQID NO:3的核苷酸55
‑
5021。本文公开的任何方法都可以使用这些组 合物进行。
[0013]本专利技术提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良的方法，所 述方法包括施用重组腺病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营 养不良蛋白的步骤，其中所述rAAV以5.0
×
10
12
vg/kg至约1.0
×
10
15 vg/kg的剂量通过全身性施用途径来施用。肌营养不良可以是杜兴肌 营养不良或贝克尔肌营养不良。
[0014]例如，所施用的rAAV的剂量为约5.0x10
12
vg/kg至约1.0x10
14 vg/kg、或约5.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良的方法，所述方法包括施用重组腺病毒(rAAV)相关rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径并且以约5.0
×
10
12
vg/kg至约1.0
×
10
15
的剂量施用。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述全身性施用途径是静脉内途径，并且所施用的所述rAAV的剂量为约2
×
10
14
vg/kg。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述rAAV的剂量以约10mL/kg的浓度施用。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过注射、输注或移植来施用。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过经大约一小时的输注来施用。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过外周肢静脉的静脉内途径来施用。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小肌营养不良蛋白核苷酸序列。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74的。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有杜兴肌营养不良，并且所述rAAV通过经大约一小时的静脉内输注以约2
×
10
14
vg/kg的剂量来施用，并且其中所述rAAV包含SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV前的微小肌营养不良蛋白基因表达的水平相比，在施用所述rAAV后，所述受试者的细胞中的微小肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。14.根据权利要求13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过活检肌肉中的蛋白质印迹来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测所述微小肌营养不良蛋白基因在所述细胞中的表达。15.根据权利要求14所述的方法，其中与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水平相比，在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少72％。16.根据权利要求13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测所述微小肌营养不良蛋白基因在所述细胞中的表达。17.根据权利要求16所述的方法，其中与施用rAAV前的微小肌营养不良蛋白的水平相比，在施用rAAV后，微小肌营养不良蛋白的水平增加至少72％。18.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV前的血清CK水平相
比，在施用所述rAAV后，所述受试者中的所述血清CK水平降低。19.根据权利要求18所述的方法，其中与施用所述rAAV前的所述血清CK水平相比，在施用所述rAAV后60天，所述受试者中的所述血清CK水平降低87％。20.根据权利要求1
‑
12中任一项的所述方法，其中与施用所述rAAV前的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，在施用所述rAAV后，所述受试者的肌肉组织中的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。21.根据权利要求20所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。22.根据权利要求20所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。23.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV前的α
‑
肌聚糖的水平相比，在施用所述rAAV后，所述受试者中的α
‑
肌聚糖的水平增加。24.根据权利要求23所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量α
‑
肌聚糖蛋白水平，从而检测所述α
‑
肌聚糖的水平。25.根据权利要求23所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量α
‑
肌聚糖蛋白水平，从而检测所述α
‑
肌聚糖的数量。26.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV前的β
‑
肌聚糖的水平相比，在施用所述rAAV后，所述受试者中的所述β
‑
肌聚糖的水平增加。27.根据权利要求26所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量β
‑
肌聚糖蛋白水平，从而检测所述β
‑
肌聚糖的水平。28.根据权利要求26所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量β
‑
肌聚糖蛋白水平，从而检测所述β
‑
肌聚糖的数量。25.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV后，所述受试者的疾病进展延迟，如通过以下测试中的任一者来测量：六分钟步行测试、起立时间、上升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持式肌力测定(HHD)、计时起立
‑
行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley
‑
III)分数。26.根据权利要求25所述的方法，其中与施用所述rAAV前的NSAA得分相比，在施用所述rAAV后至少270天，所述受试者的NSAA得分具有至少6分的改善。27.根据权利要求25所述的方法，其中与施用所述rAAV前的起立时间相比，在施用所述rAAV后至少270天，所述受试者的起立时间具有至少0.8秒的改善。28.根据权利要求25所述的方法，其中与施用所述rAAV前的上升4梯的时间测试相比，在施用所述rAAV后至少270天，所述受试者的上升4梯的时间测试具有至少1.2秒的改善。29.根据权利要求25所述的方法，其中与施用所述rAAV前的100m计时测试相比，在施用所述rAAV后至少270天，所述受试者的100m计时测试具有至少7秒的改善。30.一种在患者细胞中表达微小肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021施用于所述患者。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在施用所述rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测所述微小肌营养不良蛋白基因在所述患者细胞中的表达。32.根据权利要求30所述的方法，其中在施用所述rAAV.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量所述微小肌营养不良蛋白水平，从而检测所述微小肌营养不良蛋白基因在所述患者细胞中的表达。33.根据权利要求30所述的方法，其中通过检测大于1的每个细胞核的rAAV载体基因组拷贝数来测量所述患者中的所述微小肌营养不良蛋白基因的表达。34.一种降低有需要的患者中的血清CK水平的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021施用于所述患者。35.根据权利要求34所述的方法，其中与施用所述rAAV前的所述血清CK水平相比，在施用所述rAAV后60天，所述患者中的所述血清CK水平降低至少87％。36.一种增加患者肌肉组织中的微小肌营养不良蛋白阳性纤维的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021施用于所述患者。37.根据权利要求36所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量所述肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。38.根据权利要求36所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量所述肌营养不良蛋白水平，从而检测微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。39.根据权利要求36所述的方法，其中通过检测大于1的每个细胞核的rAAV载体基因组拷贝数来测量微小肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。40.一种增加有需要的患者中的α
‑
肌聚糖的表达的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
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5021施用于所述患者。41.根据权利要求40所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过针对肌肉活检的蛋白质印迹来测量α
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肌聚糖蛋白水平，从而检测所述α
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肌聚糖的水平。42.根据权利要求40所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的免疫组织化学来测量α
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肌聚糖蛋白水平，从而检测所述α
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肌聚糖的数量。43.一种增加有需要的患者中的β
‑
肌聚糖的表达的方法，所述方法包括将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021施用于所述患者。44.根据权利要求43所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过肌肉活检中的蛋白质印迹来测量β
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肌聚糖蛋白水平，从而检测所述β
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肌聚糖的水平。45.根据权利要求43所述的方法，其中在施用所述rAAV之前和之后，通过针对肌肉活检的免疫组织化学来测量β
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肌聚糖蛋白水平，从而检测所述β
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肌聚糖的数量。46.一种治疗患有杜兴肌营养不良或贝克尔肌营养不良的患者的方法，所述方法包括
将SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小肌营养不良蛋白构建体的核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸55
‑
5021施用于所述患者，以使得所述患者的疾病进展延迟，如通过以下测试中的任一者来测量：六分钟步行测试、起立时间、上升4梯、上升和下降4梯、北极星移动评估量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持式肌力测定(HHD)、计时起立
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行走和/或大幅运动子测试量表(Bayley
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【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：