表达SARS-CoV-2纤突蛋白（S）或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用制造技术

本发明专利技术提供一种表达SARS-CoV-2纤突蛋白(S)或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用，重组VSV病毒构建包括以下任一方法：通过SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S

【技术实现步骤摘要】
表达SARS-CoV-2纤突蛋白(S)或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用


[0001]本专利技术涉及新型冠状病毒研究
，具体地说，涉及一种表达SARS-CoV-2的 纤突蛋白(S)或其变异体的重组水泡性口炎病毒(VSV)及其构建和应用。

技术介绍

[0002]SARS-CoV-2(以下简称CoV-2)是已知的第7个人冠状病毒。根据血清型和基因组特 点，冠状病毒科被分为α、β、γ和δ四个属。CoV-2属于β冠状病毒属，该属冠状病毒 还包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重呼吸综合征相关冠状病毒 (SARS-CoV),对CoV-2全长基因组进行的系统进化分析表明，该新型冠状病毒与SARS 病毒的相似度高于MERS病毒。
[0003]CoV-2基因组为单股正链RNA，长度约为29.8Kb，其5
’
端为编码复制酶复合物的 开放阅读框(Open reading frame，ORF)1ab，占基因组全长约2/3，编码聚合酶等非结 构蛋白；后1/3区域编码纤突蛋白(Spike,S)、小囊膜蛋白(Envelope,E)、膜蛋白 (Membrane,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)。纤突蛋白(S)以三聚体的形式嵌 入病毒粒子囊膜的表面，负责病毒与宿主细胞表面受体结合，是冠状病毒最重要的中和 保护性抗原，也是疫苗研制的最主要靶抗原。最新的研究表明，CoV-2的受体与 SARS-CoV相同，均为血管紧张素转换酶2(ACE2)，然而，冠状病毒S蛋白氨基酸序列 分析也显示，SARS病毒S蛋白与ACE2互作的5个关键氨基酸位点，在CoV-2中有4 个发生了改变。这提示病毒的二者间免疫原性可能发生了显著变化。
[0004]防范病毒感染最有效的方法是使用疫苗，但目前仍缺乏控制人冠状病毒感染的有效 疫苗和成熟技术。冠状病毒具有高度的变异性，这一方面是由于该类病毒属于RNA病 毒，其RNA复制酶纠错能力低，易导致基因突变，另一方面，冠状病毒毒株之间可发 生基因重组，更增加了疫苗研制的难度。因此，如能构建一个快速研制疫苗的通用技术 平台，将有助于应对突发疫情。目前常用的研制疫苗方法包括灭活疫苗和减毒疫苗，灭 活疫苗的制备需对病毒进行大量培养，并经灭活后使用，这种方法对高致病性病毒如 SARS等的生产安全要求极高，需在生物安全3级实验室进行。病毒大规模培养，一旦 泄漏将产生巨大灾难；此外，灭活疫苗须多次接种，产生效力所需时间长，且无法有效 激发粘膜免疫。人新型冠状病毒(CoV-2)虽然已经VeroE6细胞体外分离培养成功，但病 毒高水平生产仍需对培养条件进行充分优化，包括合适的细胞系等。减毒活疫苗病毒株 的获取方法有传统细胞传代法和通过基因工程技术使病毒毒力基因缺失，但失去致病力 的减毒活疫苗有可能逆转为致病株，冠状病毒在野外易发生重组，减毒突变株在自然条 件下可与野毒株重组重新获得毒性，这些缺点使得难以在短时间内获得传统意义上的人 新型冠状病毒疫苗，需寻找新的研制方法。这其中，借助安全和技术成熟的病毒载体来 高效表达CoV-2关键保护性抗原可能是一种有效的解决途径。目前，常用的病毒载体包 括：DNA病毒载体(如腺病毒、痘病毒)；反转录病毒载体(如慢病毒)以及RNA病 毒载体(如水泡性口炎病毒和麻疹病毒)等。
[0005]1996年，John Rose课题组建立了水泡性口炎病毒(VSV)拯救(Rescue)技术， 经过基因工程改造，VSV目前已成为一个安全、高效的疫苗载体，已在用于那些难以体 外培养、致病性强的病原体，如HIV、HCV等疫苗的研发。VSV病毒载体的优点主要 包括：1.对人无致病性，比较安全；作为一种RNA病毒，不会引起宿主细胞的转化； 2.可高效表达大分子外源蛋白；3.单次接种即可快速激发机体产生全面的免疫应答，包 括粘膜免疫、细胞和体液免疫应答；4.扩增VSV所用BHK21细胞可高密度悬浮培养。 这为VSV重组疫苗进行工业化生产提供了得天独厚的优势。近年来，重组VSV已在人 用应急免疫疫苗的研制和应用上取得突破，以其为载体表达Ebola病毒囊膜糖蛋白(GP) 研制的疫苗，已投入临床应用，灵长动物单次接种该疫苗5天后即可获得有效免疫保护 力，并经受住致死剂量Ebola病毒的攻击；在冠状病毒方面，课题申请人前期也研制了 表达猪冠状病毒——猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白(S)的VSV活载体疫苗， 动物实验显示出其能在猪体内激发出良好的免疫保护力。这些成功的经验显示出，VSV 病毒载体可能是研制CoV-2冠状病毒疫苗的良好平台。与腺病毒载体不同，人自然状态 不接触VSV，体内不会有VSV的抗体，因此，接种的疫苗不会受到干扰。
[0006]VSV属于弹状病毒，其基因组约为11kb，编码5个结构蛋白，包括RNA复制酶(L)、 磷酸化蛋白(P)、核衣壳蛋白(N)、囊膜蛋白(G)和基质蛋白(M)。G蛋白负责 识别病毒受体并介导病毒入侵宿主细胞，它决定了VSV病毒的嗜性；M蛋白可分布于 细胞核，阻断宿主细胞mRNA向细胞质的转运，从而起到抑制I型干扰素表达等作用，是 病毒的最重要毒力因子。对病毒载体而言，安全性最受关注。目前，申请人以及其他学 者围绕M和G蛋白构建了一系列高度弱化的VSV病毒载体，如课题申请人前期成功地构 建了M蛋白和G蛋白双位点突变型重组VSV病毒(VSV
ΔM51-G
Δ28
)，以及一株M蛋白三 位点氨基酸突变的新型重组VSV病毒(VSV
MT
)。相比野生型VSV，这些VSV载体安全 性进一步得到提高。Ebola病毒疫苗研制采用了其它两种策略，包括：用Ebola病毒的囊 膜糖蛋白(GP)对VSV进行假型化改造，改变VSV嗜性，这是Merck公司生产疫苗所用 的策略；另外一个策略是用Ebola病毒GP蛋白基因取代VSVN蛋白基因，并将N基因移至 VSVM基因之后，得到病毒为rVSVGP1N4，这一策略不仅提高了GP蛋白整合进入VSV 囊膜的效率，而且提高了VSV的安全性。
[0007]冠状病毒的纤突蛋白(S)是一个分子量约为200kDa的I型跨膜糖蛋白，其结构包括 N末端的信号肽,胞外区段(Ectodomain,ET),跨膜区段(Transmembrane domain,TM) 以及胞内区段(cytoplasomic tail,CT)。研究显示，S蛋白诱发中和保护性抗体高度依赖 其空间构象的完整性，甚至是蛋白嵌入囊膜形成三聚体的完整性，单独或串联表位以及 S1或S2亚基均难以发挥有效保护性作用，因此，如何利用基因工程技术大量制备具有天 然构象的S蛋白一直是困扰相关疫苗研制的难题。课题申请人在PEDV的研究表明，PEDV 全长S基因克隆到VSV基因组后，无法拯救出病毒，但当S蛋白的胞内区段羧基末端19 个氨基酸敲除后，则可成功嵌入VSV囊膜。这与蛋白上羧基末端一个保守双碱基基序 (motif)结构：KxHxx有关。这个基序结构使得S蛋白定位于内质网高尔基体中间区室 (ERGIC)，而非细胞膜表面，由于VSV的出芽发生在细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，包括以下方法中的任意一种：A、通过SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S
ΔCT
蛋白构建假型化VSV病毒；B、采用M三位点突变的VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S
ΔCT
的重组VSV病毒；C、采用M和G蛋白突变的VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S
ΔCT
的重组VSV病毒；D、采用以结构蛋白顺序重排的重组VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体S
ΔCT
的重组VSV病毒。2.根据权利要求1所述的表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，方法A的具体步骤如下：A1、重组质粒构建：a11、对SARS-CoV-2病毒S基因进行碱基敲除，获得S蛋白突变体S
ΔCT
；a12、构建克隆VSV Indiana株全长基因组序列的质粒pVSV
IND
；a13、将S或S
ΔCT
基因进行高保真PCR扩增，其5
’
和3
’
末端分别含有MluI和XhoI酶切位点，经双酶切后克隆到pVSV
IND
质粒中，使S或S
ΔCT
基因替换掉VSV中的G基因，分别得重组质粒pVSV
ΔG-S或pVSV
ΔG-S
ΔCT
；A2、病毒制备：a21、用痘病毒vTF 7-3感染BHK21细胞，感染浓度为MOI＝5，1小时后去除痘病毒；a22、将重组质粒pVSV
ΔG-S或pVSV
ΔG-S
ΔCT
分别与辅助质粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L混合制备质粒转染混合液；a23、将质粒转染混合液共转染步骤a21的BHK21细胞；a24、用表达VSV G蛋白的质粒pVSV-G转染新鲜BHK21细胞，得BHK-G细胞；a25、收集步骤a23获得的细胞上清，滤去vTF 7-3病毒，所得滤液加入到BHK-G细胞中进行扩增，2-3天后收集出现病变的细胞上清；a26、将步骤a25收集的细胞上清经空斑纯化后，后续用VeroE6细胞扩增、鉴定，得假型化VSV病毒。3.根据权利要求1所述的表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，其特征在于，方法B或C的具体步骤如下：B1、重组质粒构建：b11、...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，方心葵，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：