腺相关病毒(AAV)生产细胞系和相关方法技术

本公开涉及用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系适当地包含对在可去阻遏启动子的控制下的辅助基因和AAV基因进行编码的核酸。本公开还涉及对此类基因进行编码的分离的核酸分子以及使用哺乳动物细胞生产AAV的方法。细胞生产AAV的方法。细胞生产AAV的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺相关病毒(AAV)生产细胞系和相关方法


[0001]本公开涉及用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞系。所述细胞适当地包含对在可去阻遏启动子的控制下的辅助基因和AAV基因进行编码的核酸。本公开还涉及对此类基因进行编码的分离的核酸分子以及使用哺乳动物细胞生产AAV的方法。序列表
[0002]本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且通过全文引用的方式特此并入。创建于2019年12月17日的所述ASCII副本被命名为0132
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0049WO1_SL.txt并且大小为364,567字节。

技术介绍

[0003]安全性和长期表达能力使腺相关病毒(AAV)成为用于人类基因疗法的优秀病毒载体。野生型AAV基因组由4.7kb单链DNA构成，所述单链DNA包含针对复制的调控基因(Rep)和针对衣壳的结构基因(Cap)，所述调控基因和所述结构基因侧接有反向末端重复序列(ITR)以进行病毒复制和包装。作为依赖型病毒，宿主细胞中的AAV复制需要共感染辅助病毒(如腺病毒(Ad)和单纯疱疹病毒)。可替代地，所克隆的辅助基因的表达也可以支持AAV复制。例如，重组AAV可以通过共转染以下三种质粒在HEK293细胞中生产：表达来自腺病毒的E2A、E4Orf6和VA的pHelper质粒、用于Rep和Cap蛋白的pRep
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Cap质粒以及携带期望的所关注基因(GOI)的AAV转移质粒。
[0004]目前，AAV制造依赖于若干桥接平台。除了以上所指出的HEK293细胞中的三重转染外，还可以通过将两种分别表达Rep
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Cap和GOI的杆状病毒共感染到昆虫细胞中来生产AAV。然而，这些杆状病毒在较高传代下不稳定并且制备起来很费时(参见例如Urabe等人,“昆虫细胞作为生产腺相关病毒2型载体的工厂(Insect Cells as a Factory to Produce Adeno
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Associated Virus Type 2Vectors)”,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》13:1935
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1943(2002))。还开发了具有稳定整合的Rep
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Cap和GOI的HeLa包装细胞。然而，这些系统仍然需要野生型腺病毒作为辅助病毒，这会导致AAV产品中复制性腺病毒污染的风险(参见例如Robert等人,“使用哺乳动物表达平台制造重组腺相关病毒(Manufacturing of recombinant adeno
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associated viruses using mammalian expression platforms)”,《生物技术杂志(Biotechnology Journal)》12:1600193(1
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16)(2017))。
[0005]所需要的是可轻松扩展到大批量生产的用于生产AAV的细胞系和相关方法，以提供可重复的且稳定的结果，同时限制污染并减少成本。

技术实现思路

[0006]在一些实施例中，本文提供的是一种用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括：对在第一可去阻遏启动子的控制下的病毒辅助基因进行编码的核酸分子；对在第二可去阻遏启动子的控制下的AAV基因进行编码的核酸分子；以及对所述第一可去阻遏启动子和所述第二可去阻遏启动子的阻遏子元件进行编码的核酸分子。
[0007]在另外的实施例中，本文提供的是一种用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括：对腺病毒辅助基因进行编码的核酸分子，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件。
[0008]在另外的实施例中，本文提供的是一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子对以下进行编码：腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件。
[0009]在仍另外的实施例中，本文提供的是一种在哺乳动物细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，所述方法包括：用对以下进行编码的分离的核酸分子转染所述哺乳动物细胞：腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件；用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；生产所述AAV；以及采集所述AAV。
[0010]在另外的实施例中，本文提供的是一种使用腺相关病毒(AAV)进行处理的方法，所述方法包括：用对以下进行编码的分离的核酸分子转染哺乳动物细胞：腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件；用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；生产所述AAV；采集所述AAV；以及向哺乳动物患者施用所述AAV。
[0011]在仍另外的实施例中，本文提供的是一种生产腺相关病毒(AAV)的方法，所述方法包括：用以下转染稳定表达一种或多种对TetR和/或TetR
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KRAB进行编码的核酸的哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因、E4Orf基因和病毒相关非编码RNA的腺病毒辅助基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因的AAV基因进行编码；以及任选地第三核酸，所述第三核酸对在第三可去阻遏启动子的控制下的所关注基因进行编码；用所述TetR和/或TetR
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KRAB的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括：a.对在第一可去阻遏启动子的控制下的病毒辅助基因进行编码的核酸分子；b.对在第二可去阻遏启动子的控制下的AAV基因进行编码的核酸分子；以及c.对所述第一可去阻遏启动子和所述第二可去阻遏启动子的阻遏子元件进行编码的核酸分子。2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物。3.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。4.根据权利要求1到3中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述病毒辅助基因是腺病毒辅助基因。5.根据权利要求4所述的哺乳动物细胞，其中所述腺病毒辅助基因包括E2A基因和E4Orf6基因。6.根据权利要求5所述的哺乳动物细胞，其进一步包括位于所述E2A基因与所述E4Orf6基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)元件。7.根据权利要求1到6中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述AAV基因包括Rep基因和Cap基因。8.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在第三可去阻遏启动子的控制下。9.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在包含在人工内含子内的第三可去阻遏启动子的控制下。10.根据权利要求8或权利要求9所述的哺乳动物细胞，其中所述Cap基因在天然启动子的控制下。11.根据权利要求1到10中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述可去阻遏启动子中的每一个包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(TetO2)。12.根据权利要求11所述的哺乳动物细胞，其中所述第一可去阻遏启动子的所述功能启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。13.根据权利要求1到12中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述阻遏子元件在组成型启动子的控制下。14.根据权利要求1到13中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。15.根据权利要求14所述的哺乳动物细胞，其进一步包括对转录阻遏结构域进行编码的核酸，所述核酸与对所述四环素阻遏蛋白进行编码的核酸使用相同读框。16.根据权利要求1到15中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。17.根据权利要求1到15中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。18.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中所述人细胞是人胚胎肾(HEK)细胞。19.根据权利要求1到18中任一项所述的哺乳动物细胞，其进一步包括包含两个反向末端重复序列(ITR)序列的核酸分子。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的哺乳动物细胞，其进一步包括对所关注基因进行编码的核酸分子。21.根据权利要求1到20中任一项所述的哺乳动物细胞，其进一步包括对在第四可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA进行编码的核酸分子。22.一种用于生产腺相关病毒(AAV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括：a.对以下进行编码的核酸分子：i.腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；ii.AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；iii.在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；iv.两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及v.所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件。23.根据权利要求22所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物。24.根据权利要求23所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。25.根据权利要求22到24中任一项所述的哺乳动物细胞，其进一步包括位于所述E2A基因与所述E4Orf6基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)元件。26.根据权利要求22到25中任一项所述的哺乳动物细胞，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在第四可去阻遏启动子的控制下。27.根据权利要求22到25中任一项所述的哺乳动物细胞，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在包含在人工内含子内的第四可去阻遏启动子的控制下。28.根据权利要求26或权利要求27所述的哺乳动物细胞，其中所述Cap基因在天然启动子的控制下。29.根据权利要求22到28中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述可去阻遏启动子中的每一个包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(TetO2)。30.根据权利要求29所述的哺乳动物细胞，其中所述第一可去阻遏启动子的所述功能启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。31.根据权利要求22到30中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述阻遏子元件在组成型启动子的控制下。32.根据权利要求22到31中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。33.根据权利要求25所述的哺乳动物细胞，其进一步包括对转录阻遏结构域进行编码的核酸，所述核酸与对所述四环素阻遏蛋白进行编码的核酸使用相同读框。34.根据权利要求22到33中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。35.根据权利要求22到33中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是人
细胞。36.根据权利要求35所述的哺乳动物细胞，其中所述人细胞是人胚胎肾(HEK)细胞。37.根据权利要求22到36中任一项所述的哺乳动物细胞，其进一步包括对所关注基因进行编码的核酸分子。38.一种分离的核酸分子，其对以下进行编码：a.腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；b.AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；c.在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；d.两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及e.所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件。39.根据权利要求38所述的分离的核酸，其进一步包括：位于所述E2A基因与所述E4Orf6基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)元件。40.根据权利要求38到39中任一项所述的分离的核酸，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在第四可去阻遏启动子的控制下。41.根据权利要求38到39中任一项所述的分离的核酸，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在包含在人工内含子内的第四可去阻遏启动子的控制下。42.根据权利要求40或权利要求41所述的分离的核酸，其中所述Cap基因在天然启动子的控制下。43.根据权利要求38到42中任一项所述的分离的核酸，其中所述可去阻遏启动子中的每一个包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(TetO2)。44.根据权利要求43所述的分离的核酸，其中所述第一可去阻遏启动子的所述功能启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。45.根据权利要求38到44中任一项所述的分离的核酸，其中所述阻遏子元件在组成型启动子的控制下。46.根据权利要求38到45中任一项所述的分离的核酸，其中所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。47.根据权利要求46所述的分离的核酸，其进一步包括：对转录阻遏结构域进行编码的核酸，所述核酸与对所述四环素阻遏蛋白进行编码的核酸使用相同读框。48.根据权利要求38到47中任一项所述的分离的核酸，其进一步包括所关注基因。49.一种在哺乳动物细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，所述方法包括：a.用对以下进行编码的分离的核酸分子转染所述哺乳动物细胞：i.腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的E2A基因和E4Orf6基因；ii.AAV基因，所述AAV基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的Rep基因和Cap基因；iii.在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码RNA；iv.两个反向末端重复序列(ITR)序列；以及
v.所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件；b.用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；c.活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；d.生产所述AAV；以及e.采集所述AAV。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。52.根据权利要求49到51中任一项所述的方法，其进一步包括位于所述E2A基因与所述E4Orf6基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)元件。53.根据权利要求49到52中任一项所述的方法，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在第四可去阻遏启动子的控制下。54.根据权利要求49到52中任一项所述的方法，其中Rep78基因在所述第二可去阻遏启动子的控制下，并且Rep52基因在包含在人工内含子内的第四可去阻遏启动子的控制下。55.根据权利要求54所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾炳南，C，
申请(专利权)人：隆萨沃克斯维尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：