SOD1双表达载体及其用途制造技术

在一些方面，本公开涉及用于抑制细胞(例如，受试者的细胞)中SOD1表达的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开描述了经工程化以表达靶向内源SOD1的抑制性核酸和编码强化的SOD1蛋白的mRNA的分离的核酸。在一些实施方案中，本公开描述的组合物和方法可用于治疗受试者的肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】SOD1双表达载体及其用途相关申请本申请要求保护在35U.S.C119(e)下2017年9月22日提交的、名称为"SOD1双表达载体及其用途"的美国临时申请序列号62/561,932的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
肌萎缩性侧索硬化(ALS)是进行性的且通常致命的运动神经元疾病，有时与额颞痴呆(FTD)同时发生。ALS以散发(SALS)和家族(FALS)两种形式存在。约10％的病例作为常染色体显性性状传播。FDA批准的ALS治疗剂是利鲁唑，这是一种延长存活约10％的化合物。通常，证明SOD1沉默在ALS细胞和转基因动物中有益的研究并没有描述仅沉默突变的等位基因。相反，在大多数研究中，沉默降低了突变的毒性SOD1蛋白以及野生型SOD1蛋白两者的水平。然而，自突变的和野生型等位基因两者的SOD1的过度沉默可能涉及由于野生型SOD1蛋白的活性或功能降低而导致的不希望的生物学后果。专利技术概述本公开的方面涉及用于调节细胞中胞质Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)表达的组合物和方法。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗ALS的方法。在一些实施方案中，本公开提供了被工程化以抑制细胞或受试者中内源SOD1表达的合成核酸(例如，合成的microRNA)。在一些实施方案中，本公开提供了经工程化以在细胞或受试者中表达外源SOD1的核酸。在一些实施方案中，这种外源SOD1对靶向内源SOD1的合成核酸(例如，合成的microRNA)的靶向具有抗性。因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于偶联以下各项的递送的组合物和方法：(1)合成的microRNA以沉默内源胞质Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)活性的表达，与(2)第二构建体以表达对所述合成的microRNA(miRNA)有抗性的外源SOD1。本公开部分基于本文所述的组合物和方法，其通过串联包含SOD1的抗SOD1miRNA和cDNA，解决了由于SOD1歧化而失去神经保护活性的问题，其中所述cDNA是从工程化以对抗SOD1miRNA具有抗性的RNA表达的。在一些实施方案中，本公开所述的构建体允许正常水平的SOD1歧化活性(例如，在已经施用所述构建体的细胞或受试者中)，即使使WT和突变的内源SOD1等位基因都完全沉默。因此，在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含：第一区域，其编码一种或多种第一miRNA，所述第一miRNA包含具有与受试者的内源mRNA足够序列互补以杂交并抑制内源mRNA的表达的核酸，其中所述内源mRNA编码SOD1蛋白；和第二区域，其编码编码野生型SOD1蛋白的外源mRNA，其中一种或多种第一miRNA不包含具有足以杂交并抑制所述外源mRNA表达的互补序列的核酸。在一些实施方案中，外源mRNA缺乏5'非翻译区(5'UTR)，缺乏3'非翻译区(3'UTR)，或缺乏5'UTR和3'UTR两者。在一些实施方案中，编码SOD1蛋白的外源mRNA相对于内源mRNA具有一个或多个沉默碱基对突变。在一些实施方案中，外源mRNA包含与内源mRNA至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，野生型SOD1由SEQIDNO：7(强化的SOD1序列)所示的核酸序列编码。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA靶向编码内源mRNA的核酸的非翻译区(例如5'UTR或3'UTR)。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA靶向编码内源mRNA的核酸的编码序列。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA与包含由SEQIDNO：3所示序列编码的RNA的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸的核酸杂交。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA与包含由SEQIDNO：2所示序列编码的RNA的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸的核酸杂交。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA包含SEQIDNO：4所示序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸或由其编码。在一些实施方案中，一种或多种第一miRNA包含SEQIDNO：3所示序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸或由其编码。在一些实施方案中，miRNA还包含miR-155的侧翼区或miR-30的侧翼区。在一些实施方案中，分离的核酸还包含第一启动子。在一些实施方案中，第一启动子有效地连接至如本公开所述的分离的核酸的第一区域。在一些实施方案中，第一启动子是RNA聚合酶III(polIII)启动子，例如H1启动子或U6启动子。在一些实施方案中，第一启动子是RNA聚合酶II(polII)启动子，例如鸡β肌动蛋白(CBA)启动子，或内源SOD1启动子(例如SEQIDNO：16)。在一些实施方案中，分离的核酸还包含第二启动子。在一些实施方案中，第二启动子有效地连接至如本公开所述的分离的核酸的第二区域。在一些实施方案中，第二启动子是polII启动子，例如鸡β肌动蛋白(CBA)启动子，或内源SOD1启动子。在一些实施方案中，分离的核酸还包含增强子序列，例如巨细胞病毒(CMV)增强子。在一些实施例中，第一区域定位于第二区域的非翻译区(例如，UTR)内。在一些实施方案中，第一区域位于分离的核酸的内含子内。在一些实施方案中，第一区域相对于第二区域位于5'。在一些实施方案中，分离的核酸还包含至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，分离的核酸包含全长ITR和突变体ITR。在一些实施方案中，ITR位于本公开所述的分离的核酸的第一和第二区域的侧翼。在一些实施方式中，本专利技术提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含本公开所述的分离的核酸和AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV靶向CNS组织。在一些实施方案中，rAAV靶向神经元。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白或AAVrh.10衣壳蛋白。在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的分离的核酸或如本公开所述的rAAV，和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些方面，本公开提供了用于抑制细胞中SOD1表达的方法，所述方法包括向细胞递送如本公开所述的分离的核酸或如本公开所述的rAAV。在一些实施方案中，细胞包含编码突变SOD1蛋白的核酸序列。在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有ALS的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本公开所述的分离的核酸，或有效量的如本公开所述的rAAV。在一些实施方案中，受试者包含编码突变SOD1蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，例如人受试者。附图简要说明图1显示双顺反子双功能载体的构建体设计的示意图。抗Sod1miRNA通过H1启动子表达，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸，其包含：/n(a)编码一种或多种第一miRNA的第一区域，所述第一miRNA包含与受试者的内源mRNA具有足够的序列互补性以与所述内源mRNA杂交并抑制所述内源mRNA的表达的核酸，其中所述内源mRNA编码SOD1蛋白；以及/n(b)编码外源mRNA的第二区域，所述外源mRNA编码野生型SOD1蛋白，/n其中所述一种或多种第一miRNA不包含具有充足序列互补性以与所述外源mRNA杂交并抑制所述外源mRNA表达的核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170922 US 62/561,9321.一种分离的核酸，其包含：
(a)编码一种或多种第一miRNA的第一区域，所述第一miRNA包含与受试者的内源mRNA具有足够的序列互补性以与所述内源mRNA杂交并抑制所述内源mRNA的表达的核酸，其中所述内源mRNA编码SOD1蛋白；以及
(b)编码外源mRNA的第二区域，所述外源mRNA编码野生型SOD1蛋白，
其中所述一种或多种第一miRNA不包含具有充足序列互补性以与所述外源mRNA杂交并抑制所述外源mRNA表达的核酸。


2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述外源mRNA缺乏5'非翻译区(5'UTR)，缺乏3'非翻译区(3'UTR)，或缺乏5'UTR和3'UTR两者。


3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中编码SOD1蛋白的外源mRNA相对于内源mRNA具有一个或多个沉默碱基对突变，任选地，其中所述外源mRNA包含与内源mRNA至少95％同一的核酸序列。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸，其中野生型SOD1蛋白由包含SEQIDNO：7(强化的SOD1)中所示序列的序列编码。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的核酸，其中所述一种或多种第一miRNA靶向编码内源mRNA的核酸的非翻译区(例如5'UTR或3'UTR)。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的核酸，其中所述一种或多种第一miRNA靶向编码内源mRNA的核酸的编码序列。


7.根据权利要求6所述的分离的核酸，其中所述一种或多种第一miRNA与包含由SEQIDNO：2所示序列编码的RNA的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸的核酸杂交。


8.根据权利要求6或7所述的分离的核酸，其中所述一种或多种第一miRNA由包含SEQIDNO：3和/或4中所示序列的序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸编码。


9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述一种或多种第一miRNA还包含miR-155或miR-30的侧翼区。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的核酸，其进一步包含第一启动子。


11.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中所述第一启动子与所述第一区域有效地连接。


12.根据权利要求10或11所述的分离的核酸，其中所述第一启动子是RNA聚合酶III(polIII)启动子，任选地，其中所述polIII启动子是H1启动子或U6启动子。


13.根据权利要求10或11所述的分离的核酸，其中所述第一启动子是RNA聚合酶II(polII)...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·米勒，R·H·小布朗，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：美国;US