导入有杂交的肝细胞生长因子的腺相关病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及一种包含规定的杂交的肝细胞生长因子(HGF)基因序列的腺相关病毒(AAV)载体。在使用本发明专利技术的腺相关病毒载体的情况下，可以将杂交的肝细胞生长因子基因以高转染效率转染至对象(subject)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】导入有杂交的肝细胞生长因子的腺相关病毒载体
本专利申请要求于2017年12月29日向韩国专利厅提出的韩国专利申请第10-2017-0184738号的优先权，上述专利申请的公开内容通过引用并入本说明书中。本专利技术涉及一种包含规定的杂交的肝细胞生长因子基因序列的腺相关病毒载体。
技术介绍
基因治疗是一种通过使用基因重组技术将治疗基因转染至患者的细胞内以引起靶细胞的遗传变形或表达特定蛋白质来治疗遗传疾病或疑难杂症等的方法。此时，将基因转染至活体内的物质称为运载体或载体，载体大体分为病毒载体或非病毒载体。逆转录病毒和腺病毒是典型的病毒载体，非病毒载体有裸脱氧核糖核酸(nakedDNA)和脂质体(liposome)等。肝细胞生长因子(HGF)为生长因子之一，正在进行有关各种功能的研究。作为其例如下：(1)使用脂质体作为载体的肝细胞生长因子的心脏疾病的治疗(Aokietal.，Angiogenesisinducedbyhepatocytegrowthfactorinnon-infarctedmyocardiumandinfractedmyocardium：up-regulationofessentialtranscriptionfactorforangiogenesis，ets.GeneTherapy7：417-427，2000)，(2)使用腺相关病毒作为载体的肝细胞生长因子的肝疾病的治疗(Suzumuraetal.，Adeno-associatedvirusvector-mediatedproductionofhepatocytegrowthfactorattenuatesliverfibrosisinmice.Hepatol.Int.2：80-88，2008)，(3)使用裸脱氧核糖核酸作为载体的肝细胞生长因子的糖尿病周围神经病变的治疗(Kessleretal.，Double-blind，placebo-controlledstudyofHGFgenetherapyindiabeticneuropathy.AnnalsofClinicalandTranslationalNeurology2：465-478，2015)，(4)使用裸脱氧核糖核酸作为载体的肝细胞生长因子的肌萎缩侧索硬化的治疗(Sufitetal.，OpenlabelstudytoassessthesafetyofVM202insubjectswithamyotrophiclateralsclerosis.AmyotrophLateralSclerFrontotemporalDegener18：269-278，2017)。
技术实现思路
技术问题本专利技术人致力于研发一种增大杂交的肝细胞生长因子基因的转染效率的基因转染体，上述杂交的肝细胞生长因子基因同时表达包括全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺损的变异性肝细胞生长因子(dHGF)在内的肝细胞生长因子(HepatocyteGrowthFactor，HGF)的杂合型。其结果，通过阐明在使用现有已知的杂交的肝细胞生长因子基因的小型化变异体以及作为基因转染体的腺相关病毒(AAV，Adeno-AssociatedVirus)的情况下，可显著性地提高基因转染的效率，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的在于，提供一种导入有由规定的核苷酸序列组成的外来核酸序列的腺相关病毒载体。本专利技术的再一目的在于，提供一种利用上述腺相关病毒载体进行转化的转化体。本专利技术的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗糖尿病周围神经病变(diabeticperipheralneuropathy，DPN)或肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)的组合物。本专利技术的其他目的及优点将通过下述对本专利技术的详细说明、专利技术要求保护范围以及附图得以更加明确。技术方案根据本专利技术的一实施方式，本专利技术提供一种导入有由序列5的核苷酸序列组成的外来核酸序列的腺相关病毒载体。本专利技术人致力于研发一种增大杂交的肝细胞生长因子基因的转染效率的基因转染体，上述杂交的肝细胞生长因子基因同时表达包括全长肝细胞生长因子及缺损的变异性肝细胞生长因子在内的肝细胞生长因子的杂合型。其结果，阐明了在使用现有已知的杂交的肝细胞生长因子基因的小型化变异体以及作为基因转染体的腺相关病毒的情况下，可显著性地提高基因转染效率。在本说明书中，术语“杂交的肝细胞生长因子基因”是指通过选择性拼接来同时表达两种以上的肝细胞生长因子杂合型的基因序列。更为具体地，上述两种以上的肝细胞生长因子杂合型包括全长肝细胞生长因子(fulllengthHGF，flHGF)杂合型及缺损的变异性肝细胞生长因子(deletedvariantHGF，dHGF)杂合型。针对于本专利技术的杂交的肝细胞生长因子基因，由于密码子的简并性(degeneracy)或考虑到生物中表达上述肝细胞生长因子及缺损的变异性肝细胞生长因子基因的优选密码子，可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内对编码区进行各种变形，可以在不影响基因表达的范围内进行各种变形或修饰，即使在除编码区以外的部分也是如此，这样的变形基因也包括在本专利技术的范围内。因此，本专利技术还包括具有与上述序列5的杂交的肝细胞生长因子基因实际上相同的碱基序列的多核苷酸及上述基因的片段。实际上相同的多核苷酸是指具有80％以上的序列同源性，优选地，具有90％以上的序列同源性，最为优选地，具有95％以上的序列同源性。上述杂交的肝细胞生长因子基因可以包括与人肝细胞生长因子基因的外显子1至外显子18对应的互补脱氧核糖核酸(cDNA)及插入上述互补脱氧核糖核酸的外显子4和外显子5之间的人肝细胞生长因子基因的内含子4或其片段，现有已知的这样的序列为由序列6的核苷酸序列组成的HGF-X7序列(参照KR2017-0024614(2017年03月07日公开))。但是，当将上述序列6的核苷酸序列插入腺相关病毒载体时，由于大小而受到限制。本专利技术的序列5的核苷酸序列对应于如下序列，即，通过去除对应于上述序列6的核苷酸序列的内含子4片段的序列中的一部分来在小型化序列中表现出显著提升基因转染效率的序列。具体地，例如，在把序列5的核苷酸序列导入腺相关病毒载体来转染到对象(subject)的情况下，与把现有已知的序列7的HGF-X8导入腺相关病毒载体来使用的情况相比，表现出显著提升的基因转染效率及表达效率。多核苷酸能够以裸脱氧核糖核酸(nakedDNA)的状态或包含于基因运载体的状态来传递至对象(subject)，已知基因运载体可使用质粒或病毒载体等，但是，如上所述，在本专利技术的情况下，使用腺相关病毒载体作为基因运载体。在腺相关病毒载体的情况下，可以感染未分裂细胞，并且可以感染各种类型的细胞，有关腺相关病毒载体的制备及用途的详细说明在美国公开专利公报第5139941号及第4797368号中详细公开。有关作为基因转染系统的腺相关病毒的研究在LaFaceetal，Virology，162：483486(198本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.腺相关病毒载体，其中导入有由序列5的核苷酸序列组成的外来核酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 KR 10-2017-01847381.腺相关病毒载体，其中导入有由序列5的核苷酸序列组成的外来核酸序列。


2.转化体，其利用权利要求1所述的腺相关病毒载...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳承信，郑在均，李政勋，金秀斌，
申请(专利权)人：赫利世弥斯株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR