用于NK细胞转导的方法技术

本发明专利技术公开了使用假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒将生物材料转移至激活的NK细胞中的体外方法，其包括a)NK细胞的激活，和b)将所述假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒添加至所述激活的NK细胞的步骤，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白，由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。优选地，通过将IL‑1家族细胞因子添加至NK细胞来进行NK细胞的激活。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于NK细胞转导的方法
本专利技术总体地涉及将生物材料转移至细胞中的领域，特别是涉及将生物材料转移至激活的自然杀伤(NK)细胞中。
技术介绍
自然杀伤细胞(下文也缩写为“NK细胞”)是能够检测并破坏病毒感染的细胞和恶性退化的细胞(也称为肿瘤细胞)的独特淋巴细胞群体。另外，NK细胞在接触肿瘤细胞时产生和分泌细胞因子。这些功能特征使得NK细胞成为有吸引力的用于治疗癌症的药物。临床试验强调了NK细胞的临床使用的潜能(Miller等，2005；Rubnitz等，2010；Childs&Berg2013)。为患者使用供体NK细胞(“同种异体使用”)需要细胞分离方法以将所需的NK细胞效应与不需要的、反向指示的非NK细胞(例如T细胞)的效应分开。这些方法已经很成熟(Leung2014)，并且可以在封闭的无菌系统中自动化进行(Apel等，2013)。遗传操纵是一种有前景的策略以进一步改进涉及多种临床意义(例如在癌症治疗中)的NK细胞特性(Childs&Carlsten，2015年)。例如，表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞的使用是有前途的用于癌症的治疗选择，如使用CART细胞的临床试验中所证明的。CARNK细胞可以是CART细胞的良好替代品，然而，原代NK细胞的遗传操纵代表了一项重大的技术挑战(Klingemann2014)。转染方法，如电穿孔，导致有效的转基因递送，但转基因表达是瞬时的。因此，在需要持久作用时，NK细胞的转染不能用于临床应用。此外，转染导致高的细胞死亡率，这代表了另一个主要缺点。另一方面，基于病毒载体的NK细胞转导是持久性遗传修饰的一种选择。NK细胞的逆转录病毒转导是可能的，但需要高的病毒滴度，而效率仍然很低(Suerth等，2015)。甚至更重要的是，由于逆转录病毒载体的插入诱变，逆转录病毒途径的临床使用是涉及临床研究中揭示的遗传毒性作用的关键安全问题(Aiuti&Roncarolo2009；Aiuti等，2009)。然而，在逆转录病毒载体的组内，慢病毒载体的遗传毒性较小，且代表了用于临床应用的更安全选择(Montini等，2009；Papayannakos和Daniel，2013)。不幸的是，即使在用不同的细胞因子组合刺激后并使用高的慢病毒载体滴度，也只能转导约10％的NK细胞，这可以通过NK细胞的抗病毒防御机制来解释(Sutlu等，2012)。使用高的慢病毒载体滴度以及硫酸鱼精蛋白和BX795(TBK1/IKKe复合物的抑制剂)，可以将这种转导效率提高至约40％(Sutlu等，2012)。然而，TBK1是有丝分裂必不可少的，且一般已知BX795引起细胞周期停滞，从而导致非增殖细胞(Pillai等，2015；Bai等，2015)。因此，关键的和不希望有的副作用使BX795不适合用于临床NK细胞转导，其中迫切需要稳定的转导和适当的NK细胞功能性，包括稳健的细胞增殖。在WO2013/045639A1中，公开了使用用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒载体转导静止HSC以及静息T和B细胞的方法。总之，可以临床上应用于治疗的NK细胞的有效和持久的遗传修饰的方法和/或病毒载体颗粒系统代表了当前技术无法满足的迫切需求。
技术实现思路
令人惊讶地，据发现在激活后，通过使用逆转录病毒载体颗粒，如本文公开的用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体颗粒，可以有效地转导原代人NK细胞，甚至不需要NK细胞抗-病毒防御机制的抑制剂，而静息NK细胞不能被这些载体颗粒有效地转导。转导甚至在低逆转录病毒载体颗粒滴度(如慢病毒载体颗粒滴度)下也是可检测的，并且可以达到90％以上，这是使用迄今为止报道的其他病毒载体颗粒未看到的。与现有技术的方法相比，使用低载体颗粒滴度导致更好的实用性。例如，本文公开的具有修饰的狒狒包膜蛋白的慢病毒载体颗粒具有比具有VSV-G包膜蛋白的载体颗粒高得多的转导效率(高7-10倍)。本文公开的转导方法不会触发细胞死亡或显示出对转导的NK细胞的其他毒性作用。此外，该方法不影响NK细胞有丝分裂，因此转导的NK细胞长期是高度增殖性的，其水平与未转导的对应物相同。综上，所使用的假型化逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)不存在不希望的副作用及其临床顺应性特性使得本文公开的方法对于用于治疗应用的NK细胞的稳定遗传修饰是独特的。出乎预料地，人类NK细胞的激活和本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的逆转录病毒载体颗粒的使用导致高频率的转导NK细胞。优选地，通过可溶性形式或表面结合的刺激剂或者通过饲养细胞(包括饲养细胞的部分，如膜颗粒)来激活NK细胞。更优选地，NK细胞通过至少一种生长因子如细胞因子，或生长因子如细胞因子的组合，例如，共同-γ链细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-1家族细胞因子(包括但不限于IL-1α、IL1β、IL-18、IL-33、IL-36、IL37和IL38)来激活。甚至更令人惊讶地，可以通过将不同的细胞因子与IL-1家族细胞因子组合在一起来进一步提高转导效率，例如，将IL-2和/或IL-15与IL-1家族细胞因子(如IL-18、IL-33或IL-1β)组合在一起。将IL-1家族细胞因子(如IL-18、IL-33或IL-1β)添加至其他公知的激活NK细胞的细胞因子导致NK细胞的短期激活，从而允许比使用现有技术的NK激活方法更早地有效转导NK细胞，即，在不存在IL-1家族细胞因子的情况下。这是令人惊讶的发现：在本文公开的条件下，用本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒载体颗粒转导的激活NK细胞的百分比不仅非常高，而且还保持稳定几周而不减少转基因表达。转基因表达的持续时间可以在例如2、4、6、8或更多周内维持。生物材料也可以通过本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒样颗粒而不是病毒载体颗粒转移至激活的NK细胞中。甚至更令人惊讶地，在激活和转导这些NK细胞之前从包含CX3CR1阴性和CX3CR1阳性NK细胞的样品富集CX3CR1阴性NK细胞导致了使用如本文公开的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化病毒载体颗粒的优异的增殖和转导。可以通过从包含CX3CR1阳性和CX3CR1阳性细胞的样品或NK细胞群体分离CX3CR1阳性和CX3CR1阴性细胞来实现CX3CR1阴性NK细胞的富集。也可以完全作为自动化过程，优选在GMP条件下的封闭系统中，来实施本文公开的激活NK细胞的转导方法。附图说明图1：BaEV假型化载体允许高的NK细胞转导，如通过GFP表达所证明的，但NK细胞需要被激活。图2A：实验中使用的CD3+T细胞和CD3-/CD56+NK细胞从PBMC分离，从而产生高度纯化的细胞群体。图2B：用VSV-G假型化慢病毒载体进行T细胞转导是有效的，而其甚至在高滴度下对于NK细胞是非常无效的。图2C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒将生物材料转移至激活的NK细胞中的体外方法，其包括以下步骤：/na)NK细胞的激活，和/nb)将所述假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒添加至所述激活的NK细胞，/n其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白，由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171220 US 62/607,9441.一种用假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒将生物材料转移至激活的NK细胞中的体外方法，其包括以下步骤：
a)NK细胞的激活，和
b)将所述假型化逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒添加至所述激活的NK细胞，
其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含能够与造血细胞膜结合并融合的修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白，由此将生物材料转移至所述激活的NK细胞中。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述NK细胞的激活前，所述NK细胞从来自包含CX3CR1阳性和CX3CR1阴性NK细胞的样品针对CX3CR1阴性NK细胞进行富集。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒至少包含：
嵌合包膜糖蛋白，其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体或由其组成；或
修饰的BaEV包膜糖蛋白，其中所述胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。


4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述NK细胞的所述激活通过对所述NK细胞添加至少一种细胞因子或饲养细胞或饲养细胞的膜颗粒或使用NK细胞激活试剂来实现。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种细胞因子是IL-2和/或IL-15。


6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述NK细胞的激活通过添加包含至少一种激活NK细胞的细胞因子和IL-1家族细胞因子的细胞因子组合来实现，由此导致NK细胞的短期激活。


7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·巴里，M·格兰青，W·伦格，N·默克，V·胡珀特，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE