一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；所述慢病毒载体包括pLenti‑CMV‑GFP‑EF1a‑Puro。本发明专利技术基于人源G3BP1基因和载体pLenti‑CMV‑GFP‑EF1a‑Puro，扩增了人源G3BP1基因DNA序列，成功构建pLenti‑GFP‑G3BP1重组慢病毒载体，并利用慢病毒包装系统成功构建稳定表达GFP‑G3BP1蛋白的HeLa细胞系，在探究应激刺激调控SG形成机制方面具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，尤其涉及一种G3BP1重组慢病毒载体、由此构建的稳定表达GFP-G3BP1的细胞系及其在实时监测应激颗粒形成中的应用。
技术介绍
细胞受到病毒感染、砷酸盐刺激、热休克或氧化应激时，细胞内会形成致密的颗粒状结构，称为应激颗粒(stressgranules，SG)。研究表明：外源刺激可以抑制细胞启动蛋白质翻译，导致mRNAs从核糖体中释放，非翻译mRNAs和RNA结合蛋白聚集形成SG。应激状态下，抑制细胞内SG的形成会促进细胞死亡，表明SG的形成有助于细胞应对外界刺激。SG中含有大量的翻译起始成分，包括40S核糖体亚基、poly(A)结合蛋白和翻译起始因子等，但不包含大核糖体亚基，因为翻译终止发生在大核糖体亚基进入翻译复合体之前。形成SG的主要标志蛋白包括：RNA结合蛋白(RBPs)、胞内蛋白TIA-1、TIA-1相关蛋白1(TIAR)和Ras-GTPase活化蛋白SH3结构域结合蛋白(Ras-Gap-SH3domain-bindingprotein，G3BP)，这些蛋白主要通过分子内和分子间相互作用聚集形成SG。G3BP包括G3BP1和G3BP2两个亚型，均含有以下结构域：NTF2样结构域、RNA识别基序(RRM)、酸性区域以及C端精氨酸富集区(RGG)，其中C端的RRM和RGG具有DNA/RNA解旋酶活性并参与识别RNA。G3BP1蛋白是高度保守的多结构域蛋白，近年来研究表明G3BP1对活化环鸟苷酸-腺苷酸合酶(cGAS)和识别DNA非常重要，它通过促进cGAS复合物的形成来促进cGAS与DNA的结合。G3BP1的缺失使得cGAS不能有效结合DNA，从而抑制cGAS介导的IFN形成。此外，G3BP1还是RIG-I信号通路中的重要组分，G3BP1有助于RIG-I诱导抗病毒细胞因子IFN-β的产生。这些报道说明G3BP1在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。SG是宿主应对外界应激的方式，因此对于多数病毒而言，SG能够抑制病毒复制，而许多病毒通过改变细胞内SG的成分或抑制细胞内SG的形成来逃逸SG的抗病毒作用。病毒与SG的互作机制大致分为以下三类：1)病毒对PKR-eIF2α通路的调控：汉坦病毒感染宿主后，可以抑制依赖PKR活化的SG形成，这可能是该病毒能够持续感染的关键；2)病毒“挟持”SG核心蛋白：塞姆里斯森林病毒(SFV)在感染早期，使eIF2α磷酸化从而诱导SG的形成，在感染后期，G3BP1蛋白被SFV的非结构蛋白P3(nsP3)包裹在病毒复制复合物中，抑制SG的形成；3)病毒切割SG的组分：脊髓灰质炎病毒利用自身编码的3C蛋白酶切割SG成核蛋白G3BP1，从而抑制SG的形成。以上研究结果说明病毒通过多种方式调控SG的形成，逃逸SG的抗病毒作用。不同于其他病毒，新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)是目前已知的唯一能够稳定诱导SG形成、并且在细胞中高效复制的病毒，但是机制尚不清楚。CN109897827A公开了用于研究应激颗粒的斑马鱼模型的构建方法及其用途，建立了一种用于实时观测SG形成及变化的可视化在体模型，所述模型是在所述细胞的基因组中的内源性的应激颗粒相关基因(如G3BP1基因)内或编码区两端且读框不变地插入荧光基因的斑马鱼模型。但是该模型构建方法繁琐、成功率低、成本较高，实用性差。因此，有必要提供新的技术手段研究NDV诱导SG的机制，为进一步探索病毒感染调控SG机制奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，采用表达G3BP1和GFP的慢病毒转染外源刺激的宿主细胞后，实现了对细胞内SG形成过程的监测。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；所述慢病毒载体包括pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro。本专利技术中，基于人源G3BP1基因和载体pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro，扩增了人源G3BP1基因DNA序列，成功构建pLenti-GFP-G3BP1重组慢病毒载体，并利用慢病毒包装系统成功构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系，在探究应激刺激调控SG形成机制方面具有重要意义。优选地，所述G3BP1基因包括如SEQIDNO:1所示的核酸序列；SEQIDNO:1：atggtgatggagaagcctagtcccctgctggtcgggcgggaatttgtgagacagtattacacactgctgaaccaggccccagacatgctgcatagattttatggaaagaactcttcttatgtccatgggggattggattcaaatggaaagccagcagatgcagtctacggacagaaagaaatccacaggaaagtgatgtcacaaaacttcaccaactgccacaccaagattcgccatgttgatgctcatgccacgctaaatgatggtgtggtagtccaggtgatggggcttctctctaacaacaaccaggctttgaggagattcatgcaaacgtttgtccttgctcctgaggggtctgttgcaaataaattctatgttcacaatgatatcttcagataccaagatgaggtctttggtgggtttgtcactgagcctcaggaggagtctgaagaagaagtagaggaacctgaagaaagacagcaaacacctgaggtggtacctgatgattctggaactttctatgatcaggcagttgtcagtaatgacatggaagaacatttagaggagcctgttgctgaaccagagcctgatcctgaaccagaaccagaacaagaacctgtatctgaaatccaagaggaaaagcctgagccagtattagaagaaactgcccctgaggatgctcagaagagttcttctccagcacctgcagacatagctcagacagtacaggaagacttgaggacattttcttgggcatctgtgaccagtaagaatcttccacccagtggagctgttccagttactgggataccacctcatgttgttaaagtaccagcttcacagccccgtccagagtctaagcctgaatctcagattccaccacaaagacctcagcgggatcaaagagtgcgagaacaacgaataaatattcctccccaaaggggacccagaccaatccgtgaggctggtgagcaaggtgacattgaaccccgaagaatggtgagacaccctgacagtcaccaactcttcattggcaacctgcctcatg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；/n所述慢病毒载体包括pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；
所述慢病毒载体包括pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro。


2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述G3BP1基因包括如SEQIDNO:1所示的核酸序列；
优选地，所述pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro包括如SEQIDNO:2所示的核酸序列；
优选地，重组慢病毒载体包括如SEQIDNO:3所示的核酸序列。


3.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求1或2所述的重组慢病毒载体与辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。


4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括含有权利要求1或2所述的重组慢病毒载体和/或权利要求3所述的重组慢病毒的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞包括Hela细胞。


5.一种权利要求4所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)构建权利要求1或2所述的重组慢病毒载体；
(2)将步骤(1)所述的重组慢病毒载体与辅助质粒共转染哺乳细胞，构建重组慢病毒；
(3)将步骤(2)所述的重组慢病毒转化入宿主细胞基因组，得到所述重组细胞。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述重组慢病毒载体的构建方法为将PCR扩增得到的G3BP1基因插入pLenti-CMV-GF...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙英杰，丁铲，谭磊，孟春春，仇旭升，廖瑛，宋翠萍，邵琪，于圣青，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31