【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、在组织的亚细胞水平上检测所有表达的基因并同时获得这些基因的序列和/或空间信息是具有挑战性的。
2、本专利技术描述了识别和扩增信使rna(mrna)上的特定区域的方法，该方法使用探针(所述探针包含非预定义的且随机生成的独特分子标识符(umi)并且与靶向感兴趣区域的部分并置，所述感兴趣区域含有通过逆转录捕获的mrna上的突变或序列变体)，以及复制线性探针umi的序列信息的间隙挂锁定位探针。连接的挂锁探针用作环状模板，使用滚环扩增(rca)来生成定位dna纳米球。对定位dna纳米球进行测序后，具有umi信息的cdna将被回收、提取、扩增并通过ngs进行测序。
技术实现思路
1、因此，本专利技术的一个目的是提供一种以比已知技术更高的分辨率同时获得靶序列的空间位置和序列信息的方法。
2、这里我们描述了一种方法：
3、(1)通过使用具有umi的混合环状/线性dna探针对组织上表达的mrna进行空间定位。
4、(2)用逆转录酶复制具有umi的探针的线性部分的区域下游的相邻区域的核苷酸信息。同时，将端部与探针线性部分上umi部分侧翼的靶序列互补的挂锁定位探针进行杂交，产生与umi长度相对应的小间隙，该间隙可以使用phusion dna聚合酶进行复制，生成环状模板。
5、(3)使用环状模板生成dna纳米球，其umi部分在组织上进行测序，并用作线性探针杂交和mrna坐标生成的报告基因。
6、(4)然后从组织中提取通
7、(5)然后使用具有已知分支衔接端的引物通过pcr扩增提取的含有umi的cdna链。
8、(6)环化pcr产物并进行rca扩增。
9、(7)可以通过ngs对rca产物进行测序。
10、(8)使用umi将获得的测序结果与实际组织位置进行匹配。
11、本专利技术的目的是一种获得组织样品上至少一条mrna链的靶序列的空间位置和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤：
12、a.提供线性探针，其含有a)能够结合到至少一条mrna链的结合区，和b)锚定序列，其包含位于第一定位区和第二定位区之间的umi区，和c)引物区；b.将所述线性探针的结合区与所述mrna链杂交；
13、c.使用所述mrna链作为模板互补所述线性探针，从而得到逆转录的c-dna链；
14、d.将定位分子的3'端和5'端与第一定位区和第二定位区杂交，从而产生与线性探针的umi长度相对应的间隙；
15、e.使用非链置换酶用与umi互补的核苷酸填充定位分子中的间隙，从而产生包含来自线性探针的umi区的拷贝的环状模板；
16、f.通过rca倍增组织样品上的环状模板分子，从引物区开始，从而产生圆形克隆；
17、g.至少对圆形克隆的umi部分进行测序，从而获得mrna在组织上的空间位置；
18、h.从组织中去除逆转录的c-dna链并使mrna链去杂交，从而获得单链c-dna寡聚体；
19、i.在3'端和5'端为单链c-dna寡聚体提供第一衔接引物和第二衔接引物，获得有引物的单链寡聚体；通过pcr扩增有引物的单链寡聚体；
20、j.对扩增的有引物的单链寡聚体进行测序，并通过umi序列将圆形克隆的空间信息与扩增的有引物的单链寡聚体的序列信息关联起来。
21、在第一实施方案中，首先将定位分子的结合区与mrna链杂交，然后将线性探针与定位分子杂交。换句话说，按照a)、b)、c)和d)的顺序执行步骤a)至d)。
22、在第二实施方案中，首先将定位分子与线性探针杂交，然后将其结合区与mrna链杂交。换句话说，按照a)、d)、b)和c)的顺序执行步骤a)至d)。
23、本专利技术涉及一种使用线性dna引物在给定组织中进行感兴趣基因的空间定位的方法，所述线性dna引物包含与mrna上感兴趣区域上游的区域互补的序列或与mrna聚a尾互补的聚t序列，并且还包含非结合部分，所述非结合部分包括位于用于杂交挂锁定位探针分子的两个区域(区域a&b)之间的随机序列(umi)。首先通过使用线性dna引物将mrna逆转录成cdna分子来捕获mrna上特定感兴趣区域的序列信息。
24、挂锁定位探针分子可以预先连接到线性dna引物的非结合区(区域a&b)，也可以在线性引物直接连接到组织上mrna所需区域上游的序列后与线性dna引物杂交(图1)。
25、定位探针与线性dna引物的杂交产生了开环挂锁状结构，其间隙对应于线性引物上的随机序列。该间隙由非链置换酶填充，并且两个末端连接形成闭环分子，然后可以使用寡核苷酸引物直接在组织上通过滚环扩增(rca)扩增该闭环分子。rca在组织切片上将mrna复制到cdna中的同一位置处生成dna纳米球(圆形克隆)。然后，可以通过对组织上的rca产物进行测序来解码随机且非预定义的序列，其中对每个生成的圆形克隆使用一系列坐标。
26、然后从组织中物理回收并提取利用线性引物生成的cdna。
27、然后使用pcr引物对回收的cdna进行pcr扩增，该引物退火至cdna的5'端和3'端并携带dna衔接体。
28、然后可以使用将两端连接在一起的夹板桥寡核苷酸引物将pcr扩增的产物环化。
29、然后通过滚环扩增(rca)对该环进行扩增。然后对rca产物进行测序。
30、通过ngs测序鉴定与cdna连接的线性引物的随机序列，然后可以通过对组织上相同随机序列进行测序获得的坐标将其分配到确切的组织位置。
31、通过ngs测序，可以分析基因组dna或mrna上感兴趣的目标区域、突变或核苷酸变体。
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1.一种获得组织样品上至少一条mRNA链的靶序列的空间位置和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照a)、b)、c)和d)的顺序执行步骤a)至d)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照a)、d)、b)和c)的顺序执行步骤a)至d)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤e)中填充定位分子的间隙是通过Phusion DNA聚合酶或非链置换聚合酶使用与所述环状定位子的区域杂交的引物来进行的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，间隙被填充的DNA分子的3'端和5'端彼此连接，其中UMI和所述线性定位子的第一区域充当桥夹板。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤e)中的连接反应通过DNA连接酶进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定位探针是通过首先将所述线性定位子与所述至少一条mRNA链杂交、将所述定位探针的RNA锚定区互补到逆转录的c-DNA链中、然后将所述环状定位子与所述线性定位子杂交而提供
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在3'端和5'端添加第一衔接引物和第二衔接引物之前，将所述单链寡聚体物理剪切成更小的片段。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在测序之前，将单链的衔接DNA寡聚体环化并通过RCA倍增为第二个圆形克隆。
...【技术特征摘要】
1.一种获得组织样品上至少一条mrna链的靶序列的空间位置和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照a)、b)、c)和d)的顺序执行步骤a)至d)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照a)、d)、b)和c)的顺序执行步骤a)至d)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤e)中填充定位分子的间隙是通过phusion dna聚合酶或非链置换聚合酶使用与所述环状定位子的区域杂交的引物来进行的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，间隙被填充的dna分子的3'端和5'端彼此连接，其中umi和所述线性定位子的第...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·皮纳德，S·霍索诺，R·穆勒，E·尼尔，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：
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