结合原位靶标扩增和使用RT-PCR的空间唯一分子标识符(SUMI)鉴定的方法技术

允许在亚细胞水平上对多种mRNA、蛋白和代谢物在空间上进行解析的显微成像提供有价值的分子信息，这是用于理解例如肿瘤微环境内组织异质性的关键因素。本发明专利技术描述一种方法(高密度

【技术实现步骤摘要】
结合原位靶标扩增和使用RT
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PCR的空间唯一分子标识符(SUMI)鉴定的方法


[0001]本专利技术涉及用于测序和原位定位滚环核酸集落(rolony)的方法，其包括与通过杂交和/或从组织切片的扩增的RNA或DNA的靶标捕获相结合的空间唯一分子标识符(SUMI)，用于通过体外测序进行高密度空间分析。测序方法的修改允许定位蛋白和代谢物分子。

技术介绍

[0002]已经证明了挂锁(padlock)寡核苷酸在聚合已与其杂交的核酸的短的部分方面是非常成功的。大部分挂锁方法均为通过将靶标逆转录成cDNA开始的。
[0003]挂锁方法例如公开于Lee等人的“Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ”,Science.2014年3月21日；343(6177):1360
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1363.doi:10.1126/science.1250212或Nils Schneider和Matthias Meier的“Efficient In Situ Detection of mRNAs using the Chlorella virus DNA ligase for Padlock Probe Ligation”；2020年2月5日
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Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0004]Sujatha Krishnakumar等人发表了用于人类DNA序列的靶向多重扩增的综合测定，PNAS，于2008年2月19日送审。
[0005]进一步地，WO2017143155A2公开了使用合并核酸文库进行的细胞多重改变及其分析，并且WO2018045181A1公开了生成核酸序列的文库以经由荧光原位测序进行检测的方法。
[0006]所发表的挂锁方法允许对DNA或RNA进行测序，但不会给出所测序的DNA或RNA来源的细胞和组织位置内的任何空间信息。
[0007]允许在单细胞水平上对多种mRNA进行解析的显微成像提供关于转录本的量和定位的有价值的信息，这是用于理解组织异质性、分子发育和疾病治疗的关键因素。
[0008]基于荧光原位杂交(FISH)的方法允许转录本在组织切片中被直接标记以及空间信息被捕获。然而，可使用的探针数量有限，并且荧光信号的重叠经常是一个问题。此外，经常达到共聚焦显微术的光学分辨率极限，并因此可同时检测的探针数量减少。SeqFISH+为不使用已用荧光团标记的探针而是使用含有条形码序列的转录本特异性探针的连续荧光原位杂交方法，所述条形码序列充当荧光标记的二级探针的靶位点。使用在连续数轮探测期间与这些条形码位点结合的二级探针来识别各种靶标特异性探针。通过限制由二级探针检测到的探针数量，发出荧光的数量有限，并因此信号可为可辨别的。采集多个单独的图像并将其通过计算汇总以创建复合高分辨图像而不需要高分辨仪器显微镜。
[0009]然而，尽管这些方法允许同时评估几个基因，但是转录本的序列信息未被捕获。基于单细胞RNA测序(scRNA
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seq)的其他方法可描绘整个转录组并捕获序列信息。然而，组织或单细胞水平的初始位置也经常是缺失的。其中以接近单细胞的分辨率捕获序列和空间信息两者的方法仍然是困难的挑战。一些方法已经使用了FISSEQ和BaristaSeq(以约15个碱基的有限读取长度完成任务的另一种基于间隙填充挂锁的方法)。
[0010]最近，原位基因组测序(IGS)已描述为同时对样品中的基因组进行测序和成像的方法。该方法描述通过进行短读取原位测序，然后是通过双端测序对与具有UMI的基因组序列缔合的扩增子进行扩增子解离、PCR和非原位测序，来定位唯一分子标识符(UMI)的工作流程，这由A.C.Payne等人发表，Science 10.1126/science.aay3446(2020)，首次在线公开2020年12月31日。
[0011]最近，描述了“结合使用包含空间唯一分子标识符(SUMI)的挂锁寡核苷酸的靶向RNA或c
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DNA体外测序和原位测序的方法(Method combining targeted RNA or c
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DNA in vitro sequencing using padlock oligonucleotides comprising a Spatial Unique Molecular Identifier(SUMI)and in situ sequencing)”(EP22154712.8)。该方法描述了通过原位测序(SUMI)和体外测序(SUMI和靶序列)的组合对掺入到挂锁中的靶序列的空间识别。由于靶序列和SUMI序列为同一挂锁和所得滚环核酸集落的一部分，靶标信息的密度受到细胞区域内可原位测序的滚环核酸集落数量的限制。以下专利技术正在克服这个限制。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的为用于获得至少一种RNA或单链DNA中的靶序列的空间位置和序列信息的方法，其包括以下步骤：
[0013]a.使第一寡核苷酸与至少一种RNA或单链DNA的互补部分杂交，其中第一寡核苷酸提供有作为第一PCR手柄的序列；
[0014]b.使用逆转录
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聚合酶链式反应(RT
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PCR)利用至少一种RNA或单链DNA作为模板扩增第一寡核苷酸；
[0015]c.从扩增的第一寡核苷酸中去除至少一种RNA或单链DNA
[0016]d.使第二寡核苷酸与扩增的第一寡核苷酸的互补部分杂交，其中第二寡核苷酸提供有作为第二PCR手柄的序列；
[0017]e.使用逆转录
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聚合酶链式反应(RT
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PCR)利用扩增的第一寡核苷酸作为模板扩增第二寡核苷酸，从而获得包含作为第一和第二PCR手柄的序列以及靶序列的第三寡核苷酸；
[0018]f.从扩增的第二寡核苷酸中去除第三寡核苷酸；
[0019]g.在样品上的专用空间位置处提供第四寡核苷酸，其中第四寡核苷酸包含多个多联体(concatemer)，每个多联体包含与第二PCR手柄互补的序列和至少一个包含至少2个核酸的作为空间唯一分子标识符(SUMI)的序列；
[0020]h.通过第一测序步骤确定第四寡核苷酸的SUMI的序列，以确定第四寡聚核苷酸的空间位置，从而将空间位置与SUMI序列相联系；
[0021]i.使具有第二PCR手柄的第三寡核苷酸与第四寡核苷酸的互补序列杂交；
[0022]j.使用与第四寡核苷酸互补的核苷酸作为模板，用聚合酶延伸第三寡核苷酸，从而将SUMI掺入到延伸的第三寡核苷酸中；
[0023]k.使延伸的第三寡核苷酸去杂交，并通过第二测序步骤确定延伸的第三寡核苷酸的序列；
[0024]l.将延伸的第三寡核苷酸的序列信息与在第一测序步骤中获得的空间位置信息相联系。
[0025]本专利技术的方法可进一步被用于获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于获得至少一种RNA或单链DNA中的靶序列的空间位置和序列信息的方法，其包括以下步骤：a.使第一寡核苷酸与所述至少一种RNA或单链DNA的互补部分杂交，其中所述第一寡核苷酸提供有作为第一PCR手柄的序列；b.使用逆转录
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聚合酶链式反应(RT
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PCR)利用所述至少一种RNA或单链DNA作为模板扩增所述第一寡核苷酸；c.从所述扩增的第一寡核苷酸中去除所述至少一种RNA或单链DNA；d.使第二寡核苷酸与所述扩增的第一寡核苷酸的互补部分杂交，其中所述第二寡核苷酸提供有作为第二PCR手柄的序列；e.使用逆转录
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聚合酶链式反应(RT
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PCR)利用所述扩增的第一寡核苷酸作为模板扩增所述第二寡核苷酸，从而获得包含作为第一和第二PCR手柄的序列以及靶序列的第三寡核苷酸；f.从所述扩增的第二寡核苷酸中去除所述第三寡核苷酸；g.在所述样品上的专用空间位置处提供第四寡核苷酸，其中所述第四寡核苷酸包含多个多联体，每个多联体包含与所述第二PCR手柄互补的序列和至少一个包含至少2个核酸的作为空间唯一分子标识符(SUMI)的序列；h.通过第一测序步骤确定所述第四寡核苷酸的SUMI的序列，以确定所述第四寡聚核苷酸的空间位置，从而将所述空间位置与SUMI序列相联系；i.使具有所述第二PCR手柄的所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸的互补序列杂交；j.使用与所述第四寡核苷酸互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：