基因特异性空间滚环扩增和NGS测序制造技术

本发明专利技术涉及一种以比已知技术更高的分辨率同时获得目标序列的空间位置和序列信息的方法。该方法包括通过使用具有UMI的杂交的环状/线性DNA探针对组织上表达的mRNA进行空间定位的步骤，以及在几个扩增步骤后，通过NGS获得序列信息的步骤。得序列信息的步骤。得序列信息的步骤。

【技术实现步骤摘要】
基因特异性空间滚环扩增和NGS测序


[0001]本专利技术涉及一种获得组织样品上至少一条m
‑
RNA链的目标序列的空间位置和序列信息的方法。

技术介绍

[0002]在亚细胞水平上检测组织上所有表达的基因并同时获得这些基因的序列和/或空间信息是具有挑战性的。
[0003]本专利技术描述了一种如下的方法：使用含有独特分子标识符(UMI)探针的定位环(或随后进行连接的开环)识别和扩增信使RNA上的特定区域，随后逆转录含有突变或序列变体的感兴趣区域并复制UMI的序列信息。所得的具有UMI信息的cDNA通过在组织切片上产生的滚环扩增(RCA)产物的NGS进行回收、提取和测序。
[0004]WO2020076976公开了一种通过FISSEQ获得包括空间位置在内的核酸的序列信息的方法。WO2019199579教导了一种用于类似目的的蜗牛探针系统。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术的目的是提供一种方法，其以比已知技术更高的分辨率同时获得目标序列的空间位置和序列信息。
[0006]这里我们描述了一种方法，用于：
[0007](1)通过使用具有UMI的杂交环状/线性DNA探针对组织上表达的mRNA进行空间定位。
[0008](2)用逆转录酶复制具有UMI的环状/线性DNA探针退火的区域下游的相邻区域的核苷酸信息。同时，携带UMI序列的杂交探针的环状部分可以通过Phusion DNA聚合酶得以复制，并且将所得的复制的RNA链与逆转录的cDNA连接。
>[0009](3)然后从组织中提取含有UMI的cDNA链。
[0010](4)然后用具有已知适配末端的PCR引物对所提取的含有UMI的cDNA链进行PCR扩增。
[0011](5)将PCR产物环化并进行RCA扩增。
[0012](6)RCA产物可以通过NGS进行测序。
[0013]本专利技术的目的是获得组织样品上至少一条m
‑
RNA链的目标序列的空间位置和序列信息的方法，该方法包括以下步骤：
[0014]a、提供定位探针，所述定位探针包括：a)通过能够结合环状定位器的定位器锚定区与环状定位器杂交的线性定位器，和b)能够与至少一条m
‑
RNA链结合的RNA锚定区，和c)引物序列；并且其中，所述环状定位器包含UMI区域、第一和第二引物区域以及与所述线性定位器的定位器锚定区互补的区域；
[0015]b、将带有所述RNA锚定区的所述定位探针与所述m
‑
RNA链杂交；
[0016]c、使用m
‑
RNA链作为模板互补所述定位探针的RNA锚定区，从而获得逆转录的c
‑
DNA链；
[0017]d、使用所述环状定位器作为模板从所述第一引物区域开始互补所述环状定位器，并将所得的低聚物与所述线性定位器的定位器锚定区连接，从而获得包含所述UMI区域和所述m
‑
RNA链的目标序列的扩展的逆转录c
‑
DNA链；
[0018]e、从组织样品上的第二引物区域开始将环状定位器通过RCA进行倍增，产生至少一个第一圆形克隆(rolony)(仅一个L)；
[0019]f、对所述至少一个第一圆形克隆进行空间分辨测序，从而获得所述至少一个第一圆形克隆的空间和序列信息(或者换句话说：通过对至少一个第一圆形克隆进行测序来获得空间坐标和环状定位器UMI)；
[0020]g、从组织中去除扩展的逆转录c
‑
DNA链，并将所述扩展的逆转录c
‑
DNA链与m
‑
RNA链去杂交，获得单链低聚物；
[0021]h、在3'端和5'端为所述单链低聚物提供第一和第二适配引物，获得经引物处理的单链低聚物，通过PCR扩增所述经引物处理的单链低聚物，并且通过将所述第一和第二适配引物彼此连接而使所述经引物处理的单链低聚物环化，从而产生环状的单链低聚物；
[0022]i、将所述环状的单链低聚物通过RCA倍增成第二圆形克隆；对第二圆形克隆进行测序，并通过UMI序列将第一圆形克隆的空间信息与第二圆形克隆的序列信息关联起来。
[0023]本专利技术涉及一种使用杂交探针在给定组织中对感兴趣基因进行空间定位的方法，所述杂交探针含有环状(图1A)或开环分子(图1B)，具有随机且非预定义的独特分子标识符(UMI)和两个启动区域。所述环/开环可以预先附着到线性DNA引物上(图1A和图1B)，或者在线性引物直接附着到组织上mRNA上所需区域上游的序列后，环状定位器可以与线性DNA引物杂交(图1C)。然后，可以通过使用寡核苷酸引物直接在组织上进行滚环扩增(RCA)来扩增杂交探针的环状部分，从而在给定组织上表达mRNA的确切位置处产生RCA产物。然后，可以通过对RCA产物进行测序来对随机且非预定义的UMI进行解码。
[0024]接下来，通过使用相同的杂交探针作为引物对mRNA进行逆转录，可以同时捕获在组织上被空间定位的同一mRNA上含有核苷酸变化或变体的特定感兴趣区域的所需序列信息。
[0025]在逆转录的同时，可以通过Phusion DNA聚合酶在同一逆转录cDNA链上捕获UMI信息，该Phusion DNA聚合酶由专门设计来复制环状链的DNA引物启动。一旦Phusion DNA聚合酶复制了DNA环，就可以将其连接到捕获感兴趣区域中序列信息的同一cDNA链上。如果使用开环定位探针，则在此时将其连接以形成闭环。
[0026]然后从组织中物理地回收并提取连接了UMI的cDNA。
[0027]然后使用PCR引物对回收的cDNA进行PCR扩增，所述引物在所述cDNA的5'端和3'端退火并携带DNA适配体。
[0028]然后可以使用夹板桥寡核苷酸引物将PCR扩增的产物环化，所述引物使产物两端连接在一起。
[0029]然后通过滚环扩增(RCA)对所述环进行扩增。然后对RCA产物进行测序。
[0030]通过NGS测序，感兴趣的空间标识符UMI和相关联的mRNA序列可以被分配组织位置。
[0031]通过NGS测序，可以分析基因组DNA或mRNA上的感兴趣的目标区域、突变或核苷酸
变体。
附图说明
[0032]图1示出了杂交的环状/线性定位探针的三个实施例。闭环部分(图1A)包含一个随机UMI序列、两个启动区1和2以及一个锚定序列，该锚定序列与线性定位探针部分探针的5'一半退火。图1B示出了该探针的开环版本，其中定位环可以在随后的过程中通过T4 DNA连接酶闭合。图1C示出了线性探针首先与目标杂交而后进行逆转录的版本。一旦线性探针稳定地附着到目标上，则环状定位器与线性探针杂交。对于所有这三种设计，线性探针的3'一半具有与目标mRNA基因中需要测序的感兴趣区域上游的特定区域退火的序列。感兴趣区域将包含怀疑有核苷酸变化的变体差异的序列。
[0033]图2示出了杂交定位探针如何与特定mRNA中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得组织样品上至少一条m
‑
RNA链的目标序列的空间位置和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤：a、提供定位探针，所述定位探针包括：a)通过能够结合环状定位器的定位器锚定区与环状定位器杂交的线性定位器，和b)能够与至少一条m
‑
RNA链结合的RNA锚定区，和c)引物序列；并且其中，所述环状定位器包含UMI区域、第一引物区域和第二引物区域以及与所述线性定位器的定位器锚定区互补的区域；b、将带有所述RNA锚定区的所述定位探针与所述m
‑
RNA链杂交；c、使用m
‑
RNA链作为模板互补所述定位探针的RNA锚定区，从而获得逆转录的c
‑
DNA链；d、使用所述环状定位器作为模板从所述第一引物区域开始互补所述环状定位器，并将所得的低聚物与所述线性定位器的定位器锚定区连接，从而获得包含所述UMI区域和所述m
‑
RNA链的目标序列的扩展的逆转录c
‑
DNA链；e、从组织样品上的第二引物区域开始将环状定位器通过RCA进行倍增，产生至少一个第一圆形克隆(仅一个L)；f、对所述至少一个第一圆形克隆进行空间分辨测序，从而获得所述至少一个第一圆形克隆的空间和序列信息；g、从组织中去除扩展的逆转录c
‑
DNA链，并将所述扩展的逆转录c
‑
DNA链与m
‑
RNA链去杂交，获得单链低聚物；h、在3'端和5'端为所述单链低聚物提供第一适配引物和第二适配引物，获得经引物处理的单链低聚物，通过PCR扩增所述经引物处理的单链低聚物，并且通过将所述第一适配引物和第二适配引物彼此连接而使所述经引物处理的单链低聚物环化，从而产生环状的单链低聚物...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：