通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送制造技术

本文提供经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、用于制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒、用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统、以及基因编辑和调控的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年3月16日提交的美国临时申请序列号62/644,317的优先权，其全文通过引用并入本文。关于政府支持的申明本专利技术是在国家卫生研究院和国家转化科学促进中心授予的拨款82081315号的政府支持下完成的。在本专利技术中政府享有一定的权利。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全文通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2019年2月26日，名为106887-7170_SL.txt，大小为18,492字节。背景人们已经做了修饰AAV衣壳以改善基因递送的努力。例如，WO2017/165859A1描述了一种病毒衣壳修饰，其中Cas9与病毒衣壳蛋白融合或结合以促进可定制的基因编辑。进一步的参考文献描述了使用DNA家族改组（Grimm和Kay）、对AAVrh74进行赖氨酸替换（US2015/006556）、AAVrh74的195、199、201或202位突变（US9,840,719）和对AAVrh48的修饰（EP2359866）。更进一步的参考文献详细描述了在AAV表面上示出的随机肽文库（例如，Muller(2003)Nat.Biotechnol.,Perabo(2003)Mol.Ther.,and7,588,722(GrimmandKay)）。肌营养不良症的基因治疗方法需要基因向全身肌肉细胞的全身递送。最有效的递送方式是利用人体的循环系统以将病毒散布到周围的肌肉细胞。全身递送的一个问题是，大多数血清型的AAV具有感染肝细胞的自然倾向[1]。在体内，肝细胞是肌肉细胞的大约20倍，而病毒必须在全身传递时穿过[2]。据估计，全身静脉内注射后，超过50％的AAV载体保留在肝脏中。目前，超过50％的全身性注射的病毒在肝脏中损失，在其中通常无法实现治疗效果[4]。通过将脱靶（de-targeting）载体递送至肝脏并增加肌肉特异性结合和转导，可以显著改善肌肉特异性基因表达和对患者的治疗效果，同时减少潜在的副作用。目前，用于治疗杜兴（Duchene）肌营养不良症的临床试验要求递送高水平的载体（每公斤>5E+12个载体基因组），以尝试达到肌肉中基因表达的治疗水平。肌肉特异性启动子可用于减少“脱靶”基因表达，但对增加基因表达的总体水平没有作用。通过增加肌肉特异性转导的效率，可以显著降低获得治疗益处所需的总剂量。本公开解决了现有技术的限制并且还提供了相关的优点。概述申请人提出了一种增加载体向肌肉细胞的全身递送的方法可以减少或消除病毒循环时肝细胞的感染。申请人假设，经修饰的AAVrh74衣壳比未经修饰的AAVrh74载体更有效地靶向肌肉成肌细胞和卫星细胞。本公开涉及经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。申请人已经产生了三个突变体。突变体之一（AAVmut4，在VP1衣壳的氨基酸502处的天冬酰胺变为异亮氨酸）增加对所有测试组织的全身基因递送，将转导效率提高高达56倍（根据组织，增加3至56倍）。另一个突变体（AAVmut5，在VP1衣壳的氨基酸505处色氨酸变为精氨酸）向心脏的基因递送比AAVrh74增加了几乎50倍。第三个突变体（AAVYIG或AAVYIGSR591）靶向主要存在于被认为是肌肉干细胞的卫星细胞上的受体，尽管尚未通过IHC染色确认卫星细胞趋向性（tropism）。值得注意的是，基于申请人对AAV晶体结构和α7β1整合蛋白的了解，设计AAVYIG或AAVYIGSR591被认为对骨骼肌具有较高的亲和力且对肝脏具有较低的亲和力。不受理论的束缚，申请人提供了通过增加到达靶组织（例如心脏或肌肉）的有效剂量而不增加对患者的总剂量来对患者实现治疗益处的方法。通过减少获得治疗益处所需的总剂量，更少的病毒抗原被递送给患者，理想地导致对载体的免疫应答降低和安全性提高。制造足够的基因治疗药物产品以进行后期临床试验是进一步发展的主要障碍。降低获得治疗益处的剂量需求将导致制造要求降低、制造成本降低、更快的临床试验进展以及更大的治疗更多患者的能力。因此，本公开涉及经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒和用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统。本公开的一个方面涉及一种经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）（SEQIDNO：2）或其等效物。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。本文还公开了编码经修饰的病毒衣壳蛋白的分离的多核苷酸，经修饰的病毒衣壳蛋白包括通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQIDNO：2）或其等效物。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。本文公开了包含经修饰的衣壳蛋白的重组病毒颗粒，或基本上由其组成，或进一步由其组成，经修饰的衣壳蛋白包含通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQIDNO：2）。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在特定方面，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰的AAVrh74 VP1衣壳蛋白，其包含一种或多种选自以下的修饰：在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺、在氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代、以及在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）、或其每一个的等效物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180316 US 62/644,3171.一种经修饰的AAVrh74VP1衣壳蛋白，其包含一种或多种选自以下的修饰：在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺、在氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代、以及在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQIDNO：2）、或其每一个的等效物。


2.一种重组病毒颗粒，其包含如权利要求1所述的经修饰的AAVrh74VP1。


3.根据权利要求2所述的重组病毒颗粒，其中所述重组病毒颗粒是经修饰的AAVrh74。


4.根据权利要求1-3的任一项所述的重组病毒颗粒，其进一步包含转基因或CRISPR系统。


5.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的经修饰的AAVrh74VP1和/或如权利要求2或3所述的重组病毒颗粒，所述多核苷酸任选地被包含在载体中。


6.一种重组表达系统，其用于产生如权利要求3所述的重组病毒颗粒，所述重组表达系统任选地包含如权利要求5所述的载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：斯科特·艾伦·卢伊勒，
申请(专利权)人：国家儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US