用于治疗半乳糖血症的基因疗法制造技术

本文提供了编码GALT蛋白的重组AAV载体。在本公开中还提供了用于治疗半乳糖血症的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗半乳糖血症的基因疗法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年8月30日提交的美国临时序列号62/725,225的优先权，其全部内容通过引用合并于此。背景本公开总体上涉及基因疗法领域，尤其涉及半乳糖血症的治疗。除了饮食限制含半乳糖的食物外，半乳糖血症患者目前尚无其他的治疗选择。即使严格遵守无半乳糖饮食，由于食物中含有少量半乳糖和内源性产生的半乳糖，许多患者仍患有长期的精神和身体缺陷。因此，本领域中需要有效的治疗。本公开满足了这种需求并且还提供了相关的优点。概述通过有效地将GALT基因传递至包括脑在内的细胞，来提供功能性GALT蛋白的持续表达并减轻疾病症状，所公开的基因疗法为半乳糖血症患者提供了持续的长期治疗选择。为了实现该疗法，本文提供了一种多核苷酸或重组腺相关病毒（“AAV”）载体，其包含编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（“GALT”）的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一方面，编码GALT的多核苷酸序列包含与SEQIDNO：1至少85％相同的核苷酸序列，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一方面，序列与SEQIDNO：1至少85％相同，条件是已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从SEQIDNO：1中被修饰（参见图4）。在另一方面，编码GALT的多核苷酸序列包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在另一个实施方案中，多核苷酸序列编码SEQIDNO：4的氨基酸序列或其等效物。在一方面，载体是自互补载体或单链DNA（ssDNA）载体。在一方面，重组腺相关病毒（“AAV”）包含AAV（例如侧翼为两个反向末端重复序列（ITR）的scAAV或ssAAV），或基本上由其组成，或进一步由其组成。这些ITR在序列的末端形成发夹来作为引物，从而在随后的感染步骤开始之前开始第二链的合成。第二链合成被认为是有效感染的几个阻碍之一。scAAV的其他优点包括体外和体内转基因表达的增加和延长。因此，在一方面，AAV还包含两个ITR。用于产生载体的重组AAV骨架的非限制性实施例包括选自以下血清型的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVPHP.B或AAVrh74。在另一方面，载体骨架是AAV9血清型、rh74血清型或经修饰的AAVrh74血清型。本专利技术还提供一种多核苷酸，其编码包含一种或多种选自以下的修饰的经修饰的AAVrh74VP1衣壳蛋白：在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺、以及任选地在氨基酸505处色氨酸被取代为精氨酸、以及在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR、或其每一个的等效物；或者至少85%相同的多核苷酸，条件是一个或多个、或两个或更多个、或三个或更多个、或四个或更多个修饰与所述经修饰的AAVrh74VP1衣壳蛋白中的氨基酸相同；以及这些多核苷酸的互补序列。本专利技术还提供一种经修饰的AAVrh74VP1衣壳蛋白，其包含一种或多种选自以下的修饰：在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺、在氨基酸505处色氨酸被取代为精氨酸、以及在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG、或其每一个的等效物；或至少85%相同的多核苷酸，条件是一个或多个、或两个或更多个、或三个或更多个、或四个修饰与所述经修饰的AAVrh74VP1衣壳蛋白中的氨基酸相同。编码GALT的多核苷酸序列任选地可操作地连接至启动子、组织特异性控制元件或组成型启动子。组成型启动子的非限制性实施例包括，例如，Rous肉瘤病毒（RSV）LTR启动子（任选地具有RSV增强子）、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶（PGK）启动子或EF1启动子。在一个特定方面，β-肌动蛋白启动子是鸡β-肌动蛋白（“CBA”）启动子。在另一个实施方案中，启动子选自CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、PGK1（人或小鼠）启动子、P5启动子、Ubc启动子、人β肌动蛋白启动子、CAG启动子、TRE启动子、UAS启动子、Ac5启动子、多角体蛋白启动子、CaMKIIa启动子、Gal1启动子、TEF1、GDS启动子、ADH1启动子、CaMV35S启动子、Ubi启动子、H1启动子、U6启动子或α-1-抗胰蛋白酶启动子。在另一方面，多核苷酸或重组AAV进一步包含编码增强子元件的多核苷酸。非限制性实施例包括CMV增强子、WPRE和RSV增强子。在一个特定的方面，重组多核苷酸或AAV载体包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：3至少85％相同的核苷酸序列，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一方面，序列与SEQIDNO：2或3至少85％相同，条件是已经从野生型GALT中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个（参见图4）没有从SEQIDNO：2或3中被修饰。在另一方面，重组AAV载体包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，或基本上由其组成，或进一步由其组成。如本文所述的重组多核苷酸或AAV载体可以进一步包含可检测的或纯化标记。多核苷酸或载体可以作为包含多核苷酸或媒介和载体（例如防腐剂或药学上可接受的载体）的组合物而被包含。本专利技术还提供了包含如本文所述的多核苷酸和/或AAV载体的细胞或病毒颗粒。细胞可以是原核的或真核的，并且可以包括包装细胞系。细胞和病毒颗粒可以作为包含媒介和载体（例如防腐剂或药学上可接受的载体）的组合物而被包含。多核苷酸和载体对治疗或其他方法有用，并被包含在野生型或经修饰的衣壳蛋白中。因此，本文提供包含本文公开的重组多核苷酸和/或AAV载体的AAV病毒颗粒，以及用于本文公开的方法的含有所述多核苷酸和/或病毒颗粒的组合物。本专利技术还提供了制备载体、多核苷酸和包含它们的病毒颗粒的方法。在一方面，本专利技术提供了一种用于将功能性GALT酶引入细胞的方法，其包含将细胞与如本文所述的重组多核苷酸和/或AAV载体或包含其的衣壳或病毒颗粒或组合物接触。接触可以是离体的（exvivo）或体内的。本专利技术还提供了一种用于在有此需要的对象中治疗半乳糖血症的方法，该方法包含向该对象施用有效量的如本文所述的重组多核苷酸和/或AAV载体、包含重组多核苷酸和/或AAV载体的病毒颗粒、或组合物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。本专利技术还提供了一种在可能患有半乳糖血症的对象中增加半乳糖代谢的方法，在一方面，该方法包含向该对象施用如本文所述的重组多核苷酸和/或AAV载体、病毒颗粒或组合物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一方面，所递送的量是由治疗专业人员确定的有效量。本专利技术进一步提供了一种在患有半乳糖血症的对象中减轻与半乳糖血症有关的疾病状况或症状的方法，该方法包含向该对象施用如本文所述的重组多核苷酸和/或AAV载体、病毒颗粒或组合物，或基本上由其组成，或进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1-3中的任何一个至少85％相同的序列或其每一个的等效物，其中任选地已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从其相应的野生型序列中被修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180830 US 62/725,2251.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQIDNO：1-3中的任何一个至少85％相同的序列或其每一个的等效物，其中任选地已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从其相应的野生型序列中被修饰。


2.一种分离的多核苷酸，其编码SEQIDNO：4的氨基酸或与SEQIDNO：4的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸或其等效物。


3.一种多核苷酸，其包含如权利要求1或2所述的多核苷酸的互补序列。


4.一种多核苷酸，其包含SEQIDNO：1的多核苷酸或其等效物，并且任选地其中已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从SEQIDNO：1中被修饰。


5.一种载体，其包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸。


6.根据权利要求5所述的载体，其进一步包含启动子和/或增强子元件。


7.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的多核苷酸，或根据权利要求5或6所述的载体，其进一步包含标记。


8.根据权利要求5所述的载体，其中所述载体是AAV载体。


9.根据权利要求8所述的载体，其进一步包含编码衣壳蛋白的多核苷酸。


10.根据权利要求9所述的载体，其中所述衣壳蛋白是野生型衣壳蛋白或突变的衣壳蛋白。


11.一种分离的细胞，其包含如权利要求1至4中任一项所述的分离的多核苷酸或如权利要求5至10中任一项所述的载体。


12.一种重组AAV载体，其包含编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（“GALT”）的多核苷酸序列。


13.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其中编码GALT的多核苷酸序列包含与SEQIDNO：1至少85％相同的核苷酸序列，并且任选地其中已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从SEQIDNO：1中被修饰。


14.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其中编码GALT的多核苷酸序列包含如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。


15.根据权利要求12至14中任一项所述的重组AAV载体，其中所述载体为血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVPHP.B或AAVrh74。


16.根据权利要求12至14中任一项所述的重组AAV载体，其中所述载体是AAV9、rh74、突变的rh74或AAVPHP.B。


17.根据权利要求12至16中任一项所述的重组AAV载体，其中所述载体可操作地连接至启动子、组织特异性控制元件或组成型启动子。


18.根据权利要求17所述的重组AAV载体，其中所述组成型启动子包含Rous肉瘤病毒（RSR）LTR启动子（任选地具有RSV增强子）、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶（PGK）启动子、U6启动子或EF1启动子。


19.根据权利要求18所述的重组AAV载体，其中所述β-肌动蛋白启动子是鸡β-肌动蛋白（“CBA”）启动子。


20.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其包含与SEQIDNO：2至少95％相同的核苷酸序列，并且任选地其中已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从SEQIDNO：2中被修饰。


21.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其包含如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。


22.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其包含与SEQIDNO：3至少85％相同的核苷酸序列，并且任选地其中已经从野生型序列中被修饰的核苷酸中的至少一个或多个没有从SEQIDNO：3中被修饰。


23.根据权利要求12所述的重组AAV载体，其包含如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。


24.根据权利要求12至17中任一项所述的重组AAV载体，其中编码GALT酶的多核苷酸序列编码SEQIDNO：4的氨基酸序列。


25.根据权利要求12至24中任一项所述的重组AAV载体，其进一步包含可检测或纯化标记。


26.一种病毒颗粒，其包含如权利要求12至24中任一项所述的AAV载体和一种或多种衣壳蛋白。


27.根据权利要求26所述的病毒颗粒，其中所述衣壳蛋白包含至少一种野生型衣壳蛋白。


28.根据权利要求26所述的病毒颗粒，其中所述衣壳蛋白包含至少一种非天然存在的或...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯科特·艾伦·卢伊勒，
申请(专利权)人：国家儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US