使用闭合端DNA（CEDNA）载体控制转基因的表达制造技术

本文提供了包含闭合端DNA的方法和构建体(ceDNA载体)，用于使转基因表达水平在预定水平或范围保持或维持预定义的时间，或增加细胞或受试者中的转基因表达水平，其中初次预致敏施用之后的一次或多次后续施用(例如加打或增强施用)能够调节(例如增加)转基因表达水平。提供了个性化定制个体一生中的基因疗法以便在满足个体需求的水平上表达转基因的方法，其通过初次预致敏施用(例如在0时)之后的一次或多次施用、递增地或以逐步方式调节ceDNA载体表达转基因的表达水平，借此能够将所述转基因的表达水平滴定到所期望的预定表达水平或所期望的表达水平范围。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用闭合端DNA(CEDNA)载体控制转基因的表达相关申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请第62/633,882号(2018年2月22日提交)；第62/633,757号(2018年2月22日提交)；第62/633,795号(2018年2月22日提交)；和第62/746,762号(2018年10月17日提交)的权益，其各自的内容以全文引用的方式并入本文中。本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并在此通过全文引用的方式并入。2019年2月21日创建的所述ASCII拷贝命名为080170-091190-WOPT_SL.txt并且具有116,872个字节的大小。
本专利技术涉及基因疗法领域，包括用于控制转基因或经分离的多核苷酸在受试者或细胞中表达的无衣壳载体。本文所述的技术涉及体内利用闭合端(ceDNA)载体控制转基因从无衣壳DNA载体中表达的方法，其中在一次或多次后续施用(例如增强施用或加打)的情况下，能够使表达水平在所期望的水平维持预定的时间或提高。
技术介绍
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防由能够引起病症、疾病、恶性疾病等的缺陷基因或异常调控或表达(例如表达不足或过度表达)所致的医学病状。举例来说，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送矫正性遗传物质或者通过改变或静默缺陷基因或递送治疗抗体、从而使得例如患者内的遗传物质产生治疗性表达来治疗、预防或改善。基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给靶细胞并表达来治疗。矫正基因在患者靶细胞中的递送和表达能够通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。源自于AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其它载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较弱的免疫原，因此不会触专利技术显的免疫应答(参见ii)，从而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。然而，使用AAV颗粒作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其对异源DNA的约4.5kb的病毒封装容量有限(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等，2010)，因此AAV载体的使用已限于小于150,000Da蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除该载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳的免疫原性有关，这种免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出应答，刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAVDNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。另外，通过引入含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生有衣壳的常规AAV病毒体(Grimm等人,1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫应答。另外，用于递送转基因的传统基因疗法载体(例如腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒载体等)部分地由于患者对病毒蛋白的免疫应答而典型地局限于单次施用载体于患者。另外，为了使转基因持续长期表达，典型地需要在初次施用时进行高效价施用，这会导致有害副作用。因此，用于基因疗法的传统病毒载体由于缺乏持续的长期转基因表达而缺乏效用。另外，适于此类病毒载体递送的转基因遗传物质的范围局限于病毒衣壳蛋白的病毒封装容量(例如AAV为约4.5kb)，由此排除较大转基因的递送用于疗法。就基因疗法用的常规腺相关病毒(AAV)载体来说，它们的用途由于以下原因而受到限制：单次施用于患者(由于患者的免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒封装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢。另外，已有许多报道提出了关于使用过高的病毒载体剂量的问题。大部分病毒载体还受困于关于AAV所产生的免疫原性问题。因此，本领域中对允许将多次剂量的载体用于基因疗法的技术存在着需求。另外，本领域中需要控制基因疗法载体的基因表达、同时脱靶效应最小的方法，并且对于生产和/或表达特性改进的可控重组DNA载体存在着未满足的重大需求。另外，如熟练的医师将了解，希望能够滴定转基因的表达/剂量，以便基于受试者的特定症状集合和/或疾病的严重程度来定制基因疗法治疗，并且进一步使副作用或毒性最小化。
技术实现思路
本文所述的专利技术是具有共价闭合端的无衣壳DNA载体(在本文中称为“闭合端DNA载体”或“ceDNA载体”)，其用于控制转基因在细胞中的表达，例如为了治疗疾病。具体地说，本文所述的技术涉及无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体，其用于控制转基因的表达，包括(但不限于)以下中的任一种：转基因的持续表达、转基因的长期可控表达、转基因的剂量依赖性和/或可滴定表达，以及使用本文所述的载体重复给予转基因。因此，本文公开的方法能够个性化定制个体一生中的基因疗法，以使转基因按照满足个体需求的水平表达，这是通过使转基因表达水平在预定水平维持预定的时间或替代地以剂量依赖性方式增强转基因的表达、通过在初次预致敏施用之后进行一次或多次施用，由此基于ceDNA载体在加打施用时的浓度将转基因表达水平控制在所期望的表达水平或所期望的表达水平范围，从而使转基因在细胞或受试者中的表达出现可控且特定的增强。因此，在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体能够再施用(在本文中也称为“加打”或“增强”施用)，以使转基因表达水平在预定水平持续预定的时间，或使转基因的表达水平增加而高于之前的表达水平，之前的表达水平是在第一次或之前的ceDNA载体施用时达成，其中第二次施用或增强施用因对影响转基因表达的载体本身不产生免疫应答而不产生妨碍转基因表达的免疫反应，或其中免疫反应小于包含病毒蛋白的病毒载体(包括(但不限于)包含衣壳的病毒载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控转基因在受试者中的表达的方法，其包含：/na.向受试者施用足量的无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体以表达可测量水平的所述转基因，所述载体包含含有至少一个转基因的核酸盒，所述转基因可操作地连接到介于侧接的反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，其中所述转基因编码治疗疾病的所期望蛋白质；并且/nb.通过向所述受试者施用至少第二剂量的所述ceDNA载体来滴定所述ceDNA载体，以使得所期望的蛋白质的所述转基因表达在预定水平维持预定的时间或使所期望的蛋白质的所述转基因表达增加到预定水平，所述ceDNA载体包含所述至少一个介于侧接的ITR之间的转基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180222 US 62/633,757;20180222 US 62/633,882;20181.一种调控转基因在受试者中的表达的方法，其包含：
a.向受试者施用足量的无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体以表达可测量水平的所述转基因，所述载体包含含有至少一个转基因的核酸盒，所述转基因可操作地连接到介于侧接的反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，其中所述转基因编码治疗疾病的所期望蛋白质；并且
b.通过向所述受试者施用至少第二剂量的所述ceDNA载体来滴定所述ceDNA载体，以使得所期望的蛋白质的所述转基因表达在预定水平维持预定的时间或使所期望的蛋白质的所述转基因表达增加到预定水平，所述ceDNA载体包含所述至少一个介于侧接的ITR之间的转基因。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之后评估所述受试者以确定所述滴定剂量。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述评估是在步骤(a)之后确定所述受试者的疾病状态或所期望的蛋白质在所述受试者中的表达水平。


4.一种调控转基因在受试者中的表达的方法，其包含：
a.向所述受试者施用足量的无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体以表达可测量水平的所述转基因，所述载体包含含有至少一个转基因的核酸盒，所述转基因可操作地连接到介于侧接的反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，其中所述转基因编码所期望的蛋白质；以及
b.向所述受试者施用至少第二剂量的所述ceDNA载体，所述ceDNA载体包含至少一个介于侧接的ITR之间的转基因，以(i)使所期望的蛋白质的表达在预定水平持续预定的时间或(ii)将所期望的蛋白质的表达调节到预定水平。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述ceDNA载体的第二次施用不产生足以妨碍所期望的蛋白质的表达达到预定水平的免疫反应。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体与药学上可接受的载剂组合施用。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第二次施用是在所述转基因的表达水平相对于所期望水平降低时进行。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第二次施用是在第一次施用之后的至少90天进行。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述转基因编码治疗蛋白且所述转基因的期望表达水平是所述治疗蛋白的治疗有效量。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体存在至少三次施用，并且所述施用都没有对所述ceDNA载体产生妨碍所期望的蛋白质的表达达到所述预定水平的免疫应答。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述施用定期进行。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第二次施用是为了使所期望的蛋白质的表达水平增加。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二次施用是为了使所期望的蛋白质的表达在表达的预定水平延长。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所期望的蛋白质是抑制蛋白。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抑制蛋白是抗体或融合蛋白。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所期望的蛋白质替换缺陷蛋白质或未被表达的蛋白质。


17.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述启动子是诱导型或可抑制型启动子。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述转基因处于调控开关的控制下。


19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在第一、第二或任何后续时间点施用的所述ceDNA载体是包含所述相同转基因或经修饰的转基因的相同类型的ceDNA载体。


20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述第二ceDNA载体具有可操作地连接到所述相同转基因或经修饰的转基因的不同启动子。


21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述两个反向末端重复序列(ITR)是AAVITR。


22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中至少一个ITR包含功能末端解析位点和Rep结合位点。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述AAVITR是AAV-2ITR。


24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述侧接的ITR是对称或不对称的。


25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述侧接的ITR是对称或基本对称的。


26.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述侧接的ITR是不对称的。


27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述ITR中的一个或两个是野生型，或其中所述ITR中的两个都是野生型。


28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述侧接的ITR来自不同的病毒血清型。


29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述ITR中的一个或...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·科尔，M·G·斯坦顿，M·基奥科，M·D·安格里诺，R·M·科廷，P·萨马约亚，
申请(专利权)人：世代生物公司，
类型：发明
国别省市：美国;US