作物中的生物氮固定制造技术

一种转化植物细胞的线粒体以表达固氮酶的方法，其包括将植物细胞暴露于靶向线粒体的纳米载体多肽和一种或多种编码固氮酶的核酸。一种或多种编码固氮酶的基因可以是一种或多种克雷伯氏菌属(Klebsiella)nif基因。方法可用于产生具有固定大气的元素氮的能力的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作物中的生物氮固定
技术介绍
本申请涉及将植物基因工程化为能够固定大气的元素氮(分子氮；N2)的方法。更特别地，本申请涉及基因转化植物细胞的线粒体以表达固氮酶的方法。提高包括小麦、玉米和大米的谷物作物的生产力的关键因素是肥料，特别是氮和磷肥料的使用。目前，全世界人口消耗的食物中有一半以上是使用氮肥料生产的，其有助于40-60％的作物产量。然而，氮肥料如氨(NH3)和尿素(NH2CONH2)的生产和使用对环境可具有严重的不利影响。从元素氮(N2)和氢(H2)生产的用于肥料的氨的哈伯-博世(Haber-Bosch)工艺需要大量使用通常从化石燃料中获得的能源。此外，氮肥料的过度使用或低效使用可导致过多的肥料流失到环境中。所产生的富营养化可导致生物多样性的变化和水质的下降。此外，氮肥料的反硝化产生温室气体一氧化氮(N2O)，其可导致全球变暖。在不损失作物生产力的情况下减少对氮肥料的需求将对农民和环境两者提供好处。固氮(diazotrophic)原核微生物可通过将N2转变为可被附近植物吸收的生物学上有用的含氮化合物来“固定”大气的N2。这些微生物产生多亚基(subunit)固氮酶(也称为二氮酶)金属酶复合物，其催化N2还原为NH3并且是对氧气敏感的，以及依赖于高水平的ATP和还原剂。固氮酶活性是由在操纵子中组织的大量高度保守的nif基因编码。例如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中存在二十个这种基因。固氮酶复合物本身的组分由基因nifH、nifD、nifK和nifY编码。基因nifD和nifK分别编码二氮酶的异四聚体铁-钼组分(组分I)的α和β亚基，而nifH基因编码同源二聚体铁蛋白组分(组分II)的亚基。nifY基因编码铁钼辅因子生物合成蛋白，其最初与铁钼蛋白固氮酶(apodinitrogenase)寡聚体缔合，但当通过添加铁-钼辅因子激活铁钼蛋白固氮酶时，与复合物解离。其他nif基因也涉及二氮酶的调控、组装、成熟和功能。特别地，基因nifE、nifN、nifX、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifB和nifQ涉及辅因子生物合成，基因nifJ和nifF涉及电子转移，并且基因nifL和nifA涉及nif基因表达的调控。已经考虑了各种方法来利用生物氮固定，以便减少谷物植物的栽培中对氮肥料的依赖。一种可能的方法是生产基因工程化的固氮生物和/或谷物植物，其可以形成共生关系，类似于如根瘤菌的某些固氮生物可通过如下与如豆类的某些植物形成的内共生关系：通过侵入植物的根部组织，使响应于入侵形成的根瘤群集(colonizing)，并提供促进植物生长的益处，其包括释放氮固定产物以被植物吸收。另一种方法是改进与谷物自然地缔合的氮固定细菌内生菌，如固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮弧菌属(Azoarcus)和草螺菌属(Herbaspirillum)的某些物种的效率。然而，这两种方法都依赖于生物肥料接种剂的使用，其有效性可能不总是可靠的。此外，即使在谷物植物中已发现了与生节有关的生化因子，这些因子在谷物作物中的作用还未完全了解。可替选的方法是将谷物植物工程化以携带和表达nif基因，从而提供这些植物自身固定元素大气氮的能力。然而，到目前为止，这该方法仅部分地成功。质体和线粒体是提供潜在的亚细胞定位以表达固氮酶的细胞器。两种类型的细胞器可提供固氮酶发挥作用所需的ATP和电子，尽管质体和线粒体在它们的内部O2水平和它们将铵并入氨基酸的能力方面不同。植物非核细胞器在细胞核上作为固氮酶表达的亚细胞位置的其他优势包括质体和线粒体的细菌起源、线粒体和质体内的小的基因组尺寸、基因组拷贝的丰度以及类似于细菌中的那些的基因调控机制的存在。此外，线粒体或质体中没有表观遗传作用或沉默，其导致可再生的和可遗传的蛋白质积累。尝试在叶绿体中表达nif基因已经部分地成功。然而，线粒体提供了具有由分解代谢产生的低氧水平和高能量含量的环境，以支持需要能量的N2代谢途径，因此潜在地是表达固氮酶的合适位置。因此，期望提供在植物细胞线粒体内表达固氮酶基因的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供了转化植物细胞的线粒体以表达固氮酶的方法，方法包括将植物细胞暴露于靶向线粒体的纳米载体多肽和一种或多种核酸，其中一种或多种核酸包含一种或多种编码固氮酶的基因。在至少一个实施方式中，一种或多种编码固氮酶的基因包括一种或多种nif基因。在至少一个实施方式中，一种或多种核酸进一步包括至少一种选择标记基因。在另外的方面中，本专利技术提供了基因工程化植物细胞，其包括通过本文所述方法转化的线粒体。本专利技术的进一步方面提供了包括基因工程化植物细胞的基因工程化植物以及从基因工程化植物细胞产生基因工程化植物的方法。附图说明本专利技术的进一步特征将从以下书面描述和附图变得显而易见，其中：图1A是示出通过将各种靶向线粒体的肽(mTP)与6千碱基对(kb)的线性DNA以按重量计肽与DNA的各种比例孵育15分钟形成的纳米复合物的Z-平均尺寸的图；图1B是示出图1A的纳米复合物的ζ-电位的图；图1C是示出图1A的纳米复合物的按数目计(bynumber)的最小尺寸；图1D是示出图1A的纳米复合物的按数目计的峰尺寸；图1E是示出图1A的纳米复合物的按数目计的最大尺寸；图1F是示出通过以按重量计15:1的比例的肽与DNA孵育15分钟制备的图1A的纳米复合物的稳定性的图，其通过以15分钟的间隔进行Z-粒度仪(sizer)分析来确定；图1G是示出通过以按重量计100:1的比例的肽与DNA制备的图1A的纳米复合物的稳定性的图，其通过以15分钟的间隔进行Z-粒度仪分析来确定；图2A是示出通过将不同尺寸的DNA(1-8kb长的线性DNA或11或22kb质粒DNA)与mTP4以按重量计100:1的肽:DNA比例孵育15分钟产生的纳米复合物的Z-平均尺寸的图；图2B是示出通过将3kb长的线性DNA或2.8kb质粒DNA与mTP4以按重量计15:1的肽:DNA比例孵育15分钟产生的纳米复合物的Z-平均尺寸和以15分钟间隔进行Z-粒度仪分析的图；图2C是示出图2A的纳米复合物的稳定性的图；图3A是产酸克雷伯氏菌中发现的nif基因簇的示意性图示；图3B是用于黑小麦和小麦线粒体中nif基因簇的表达的优化的构建体的示意性图示，其包括除植物线粒体启动子P1(TaatpA；普通小麦(Triticumaestivum)ATP合成酶亚基α)、P2(Taatp6；普通小麦ATP合成酶亚基6)、P3(Atatp6；拟南芥(Arabidopsisthaliana)ATP合成酶亚基6)、P4(Ntatp6；普通烟草(Nicotianatabacum)ATP合成酶亚基6)和P5(TacoxII；普通小麦细胞色素c氧化酶亚基II)以及终止子序列T1(Ntatp6；普通烟草ATP合成酶亚基6)和T2(TacobA；普通小麦细胞色素B)(未本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转化植物细胞的线粒体以表达固氮酶的方法，所述方法包括将植物细胞暴露于靶向线粒体的纳米载体多肽和一种或多种核酸，其中所述一种或多种核酸包括一种或多种编码固氮酶的基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180122 US 62/619,9491.一种转化植物细胞的线粒体以表达固氮酶的方法，所述方法包括将植物细胞暴露于靶向线粒体的纳米载体多肽和一种或多种核酸，其中所述一种或多种核酸包括一种或多种编码固氮酶的基因。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种编码固氮酶的基因包括一种或多种nif基因。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种nif基因是来自克雷伯氏菌属的物种的基因。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述一种或多种nif基因包括nifH、nifD和nifK。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸进一步包括至少一种选择标记基因。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述选择标记基因选自编码氨基糖苷-3”-腺苷酰基转移酶的基因和编码D-氨基酸氧化酶的基因。


7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·欧德斯，A·齐米诺维奇，
申请(专利权)人：加拿大农业及农业食品部，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA