在植物中生产猪生殖和呼吸综合征口服疫苗制造技术

披露了一种用于制备猪生殖和呼吸综合征病毒蛋白的方法。该方法包括获得编码所需蛋白的基因，然后将该基因插入适于转化植物的载体中，并用该载体转化植物。在所述转化植物生长之后，可以收获所需要的组织，并从所收获的组织中提取所述蛋白。本发明专利技术还涉及对猪进行抗猪生殖呼吸综合征免疫的方法，包括收获所述转化的植物，以便获得收获的组织，并用所述收获的组织喂养猪，或者从收获的组织中提取所述蛋白，并作为饲料添加剂或作为注射剂给猪施用所述蛋白。不过，如果需要还可以在收获之前直接用所述植物组织喂养。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在植物中生产动物疫苗。更具体地讲，本专利技术涉及表达获自或源于猪生殖和呼吸综合征病毒的至少一个基因。本专利技术还涉及相关蛋白的纯化和服用，以便在猪体内诱导保护性抗体的产生。本专利技术背景猪生殖和呼吸综合征(PRRS)是作为一种重要的猪传染病出现的。自从这种病于1987年在美国首次发现以来(Keffaber1989)，PRRS已快速蔓延，并且现在已成为世界范围内养猪业的一个严重问题。在依阿华州的一个地区，这种病导致了85000头猪的死亡，而在欧洲，在1990/91的冬季估计出现了超过一百万头以上的死亡(Anon1990，综述文献参见Meredith1995)。在加拿大，PRRS感染在安大略和魁北克更加流行，不过，还报导了在其他省份的爆发情况(Morin和Robinson1991，Dea等1992，Sanford1992)。临床现象从严重爆发到持续感染不等。饲养母猪的严重症状包括流产、早产和死胎，而对小猪来说，呼吸疾病更常见的是导致高达80％的断奶前死亡(Loula1991，综述文献可以参见Chritianson和Joo1994)。持续感染的动物可能在临床上没有症状，但会持续释放病毒，并且它是向新生动物传播病毒的重要来源。在严重爆发情况下，受感染的饲养场，可能平均损失其每年断奶小猪生产的10％。由PRRS病毒感染在每头母猪上所造成的直接损失估计为70-350美元，并且每头母猪的潜在的效益损失还有440美元(Meridith1995，Muirhead1992，Polson1990)。由于延长了达到屠宰重量所需要的平均时间(达7天)所导致的生长速度降低造成了幼猪/肥育猪的损失。另外，很多国家禁止从受感染的国家进口活猪和精液，这进一步造成了加拿大生猪出口的经济损失(Anon1992)。迫切需要建立合适的控制措施，以防PRRS病毒的感染，以使加拿大，特别是有大量养猪场的安大略的养猪业保持活力和竞争力。在临床上，大部分猪在从初次感染中恢复之后变得对进一步的PRRS病毒感染有免疫力。用失活的PRRS病毒免疫的母猪还能防止流产。以上发现表明，主动的免疫能够诱导对保护猪不受PRRS病毒感染来说重要的中和抗体反应(Albina1992)。通常，有两种类型的疫苗能对动物进行主动免疫减活疫苗和灭活疫苗。减活疫苗通常更具有免疫原性，因此可以诱导更高效价的抗体反应和持续时间更长的免疫反应。不过，常规减活疫苗是通过诸如自发突变或随机突变的不确定的机制产生的。因此，活的疫苗具有在免疫时恢复该疫苗菌株的毒力和实际发病的潜力。相反，失活的灭活疫苗是安全的，但通常在免疫原性方面较差，并需要大剂量的抗原。因此，生产专门供兽医使用的这种疫苗成本太高。现代重组DNA技术，使得我们能够通过在植物中生产重组亚基PRRS病毒抗原来开发安全的、有效的、低成本的疫苗。含有哺乳动物基因蛋白的转基因植物的育成是植物生物技术的一个重大发展(Lefebvre等1998)。从那时起，业已表达了多种哺乳动物基因，并且业已认识到植物是有效的、低成本的、不用灭菌的生物反应器，它具有生产对医药和工业有价值的蛋白的巨大潜力。植物是高等真核生物，并且能够正确使蛋白折叠和糖基化，而细菌系统不能。可以用表达PRRS病毒抗原的植物饲养猪，并因此使得猪对所述病毒性疾病免疫。我们的方法可用于开发未来的兽医用疫苗候选物，这种疫苗不仅能保护猪免受PRRS病毒感染，而且还能使动物不受很多其他传染病的感染。猪生殖和呼吸综合征(PRRS)是一种在猪身上新鉴定的传染病，并且业已成为一种养猪业中最重要的疾病。最近业已分离了PRRS的致病剂，并且它似乎属于已知为Arterivirus类型的不确定类型的病毒(Plagemann和Meonnig1992，Meulenberg等1993)。Arterivirus还包括三种其他病毒马贫血病毒、猴出血热病毒、和小鼠乳酸脱氢酶病毒。猪体内的PRRS病毒是一种包膜病毒，含有15kb的单链RNA基因组，具有阳性极性。最近业已用在欧洲分离的原形Lelystad病毒测定了其完整的基因组序列(Meulenberg等1993)。PRRS病毒及其他arteriviruses似乎具有冠状病毒的基因组组构和表达策略(Snijder等994)。在病毒基因组中鉴定了8个开放读框(ORFs)。人们认为ORF1a和1b编码病毒基因组复制和转录所必需的RNA聚合酶。ORF7编码与病毒基因组RNA相互作用并将其包入衣壳的核壳蛋白。计算机预测业已表明，ORF2-6编码与病毒外膜相关的膜蛋白。在上述潜在的膜蛋白中，ORF5是一种主要结构蛋白，业已在纯化的病毒颗粒中鉴定到这种蛋白(Loemba等1996)。ORF6也是一种膜蛋白，但它与其他arteriviruses不同，它不是诱导中和抗体反应的抗原。ORF2、ORF3、和ORF4蛋白尚未鉴定，因此，其生物学功能在目前大多未知。对于小鼠的乳酸脱氢酶病毒来说，用单克隆抗体进行的研究业已表明，ORF5蛋白是诱导中和抗体的一种主要病毒抗原(Plagemann和Moennig1992)。还有报导说ORF2可能在小鼠中诱导中和抗体方面起着次要作用。在JP08205858和US5,510,258中分别披露了在上皮细胞或组织培养系统中生产PRRS病毒蛋白。类似地，US5,510,258提供了一种用于生产PRRSV的组织培养基础系统。在WO96/04010和WO94/18311中，将一种绿猴肾细胞系用于生产所述病毒，而在WO95/31550中，所述疫苗是用一种杆状病毒表达系统生产的。另外，EP732340披露了用一种合适的宿主系统作为杆状病毒的优选宿主生产糖基化形式的PRRSV。后一个申请还涉及ORFS2-4的表达。WO96/21012涉及用苜蓿和烟草作为植物表达系统生产免疫球蛋白。上述文献没有一件披露或暗示用植物宿主制备获自PRRS病毒的蛋白。当给小鼠口服从转基因植物组织中提取的粗制蛋白时，发现这种在转基因植物中产生的细菌抗原(大肠杆菌肠毒素)能有效免疫小鼠(Haq等1995)。业已将植物用于生产疫苗抗原，用于诸如乙型肝炎病毒和Norwalk病毒的病毒疾病免疫(Mason等1992，1996)。所述抗原可用于小鼠的口服免疫，并且就Norwalk病毒抗原来说相当通过杆状病毒感染的昆虫细胞培养产生的抗原。用农杆菌属介导的转化转化植物，并且通过直接喂给植物组织或作为粗制蛋白提取物服用所述抗原。业已通过在植物病毒的表面上表达病毒表位，然后用所述改性病毒感染易感宿主生产了抗诸如貂肠病毒的动物疾病和诸如脊髓灰质炎的人类疾病的植物产生的疫苗(Dalsgaar等1997，Haynes等1986)。所述植物病毒是从组织中纯化的，并给实验动物服用。尽管该系统是非常有效的，但它所能产生的抗原的大小局限于37个氨基酸，这就要求抗原的表位图是完整的(Yusibov等1997)。情况并不总是这样，特别是对新发现的疾病来说，表达完整长度的蛋白是唯一的选择。另外，表达是瞬时的，并且在农业水平上污染也是一个问题。用植物作为生物反应器的引人注目的证据是在两篇最近的论文中提出的，第一篇论文证实了一种分泌性免疫球蛋白的四条链在植物中的正确表达和组装，而且这种抗体具有所有的功能(Ma等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备至少一种猪生殖和呼吸综合征病毒蛋白的方法，包括：ｉ）获得编码所述蛋白的基因；ｉｉ）将所述基因插入适于转化植物的载体中；ｉｉｉ）用所述载体转化植物；和ｉｖ）生长所述转化植物。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：R赖默森，J张，D尤，L艾利森，J布兰德勒，
申请(专利权)人：加拿大农业及农业食品部，圭尔夫大学，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]