一种用质粒转化细菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种用质粒转化细菌的方法，该方法能够提高细菌转化效率。该方法是利用不同形态的质粒在温度变化时的不同表现来达到去除非目标质粒的目的，从而提高目标质粒的比率。在细菌转化时，转化用的环状质粒有两种形态，一种是开环质粒，一种是闭环质粒。在高温变性处理后，开环质粒的两条链会彻底分离成两条单链，而在随后的快速复性时无法有效恢复，而闭环质粒的两条链虽然也会分开，但会在随后的复性过程中快速恢复，而单链的质粒无法有效转化细菌。如果目标质粒是闭环质粒，那么高温变性处理可以有效提高闭环质粒在转化体系中的比例，从而降低随后筛选克隆的工作量。

【技术实现步骤摘要】
一种用质粒转化细菌的方法
本专利技术涉及一种用质粒转化细菌的方法，特别涉及对转化质粒进行预处理后转化细菌的方法。
技术介绍
将外源DNA转入到生物细胞内实现某种功能需求是现代生命科学的基本操作之一。这个操作包括两个部分，第一部分是将外源DNA(主要是质粒)转入到细胞内，得到单克隆；第二部分是从得到的单克隆中筛选目标细胞株。在细菌中，这个操作一般是通过化学转化或电转化将目标质粒转移到细菌细胞内，在培养皿上筛选单克隆菌株来实现的。有两个指标是转化时非常重要的，1)是转化效率，是指单位质量的DNA转化后产生的菌落数，单位是cfu/μg，比如一个大肠杆菌的转化效率是1000000cfu/μg，是指1μg标准载体转化后理论上可以得到1000000个菌落。2)是目标克隆比例，是指在转化后产生的单克隆菌落中，符合目标需求的菌落数与总菌落数的比值。第一个指标越高，转化的总体成功率也越高；而第二个指标越高，筛选目标单克隆的成本就越低。本专利技术的目的就是提高第二个指标，即目标克隆比例。一般在大肠杆菌的转化中，只有环状的质粒才能有效转化，而成环的方式有两种：1)是用连接酶将线性双链DNA连接起来，如果最后一条线性DNA的两端也被连接起来，那么这个质粒就被环化了；2)通过同源臂将线性DNA组装起来，如果两个线性DNA的末端存在重叠，通过一定方式在末端产生单链区，那么在碱基配对原则下，这两个末端会发生组装，环化就是一条线性DNA的两个末端发生了这种组装。环化的质粒有两种状态：1)是开环，即质粒DNA双链的两条链中有一条或两条出现共价断裂；2)闭环，即质粒DNA双链的两条链不存在共价断裂。一般开环和闭环质粒都能有效转化大肠杆菌，因为开环的质粒在进入细胞后会被细胞的DNA修复机制修复成闭环质粒。在质粒转化出现的近50年间，为了提高目标克隆的比例，有多种方法被发展出来，比如质粒的蓝白斑筛选(Vieira,J.；Messing,J.(1982)."ThepUCplasmids,anM13mp7-derivedsystemforinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticuniversalprimers".Gene.19(3):259–268)，在这种方法中，含有外源DNA的菌株在培养皿中是白色的菌落，而没有外源DNA的菌株一般是蓝色的，这样只要选择白色菌落就能有效提高目标克隆的比例。在亚克隆时，用磷酸酶处理载体(Ullrich,A.etal.(1977)Ratinsulingenes:Constructionofplasmidscontainingthecodingsequences.Science196,1313–9.)也能有效降低转化后背景菌落的产生。用毒性基因/抗毒性基因的组合(BernardP,GabantP,BahassiEM,CouturierM(October1994)."Positive-selectionvectorsusingtheFplasmidccdBkillergene".Gene.148(1):71–4)能实现只有存在外源DNA能生长，而不存在外源DNA的细菌会被杀死的目的。以上方法都是用来筛选外源DNA的，但存在外源DNA的菌株并不一定就是目标克隆，这是因为不管是连接酶法还是同源重组的方法，都存在错误拼接的可能，这些错误拼接主要是：1)非碱基配对原则下的组装/连接，2)设计之外的不对称连接，比如有些3碱基的粘端能够与4碱基的粘端之间连接，产生不对称的两条链。还有一些3’突出末端能够与平末端发生不对称连接，这个现象在专利公开号为CN104212791A所描述的基因合成方法中较常出现，这会导致转化菌落中有一定比例是非目标克隆。不对称连接意味着成环的质粒中，至少有一条链是不连续的，即质粒是开环的。本专利技术的方法可以有效去除这种不对称连接。
技术实现思路
本专利技术涉及用质粒转化细菌的方法，该方法通过高温变性处理，可以有效去除不对称连接，有效提高细菌转化时目标闭环质粒在转化后菌落中的比例，即提高目标克隆比例的比例。本专利技术提供用质粒转化细菌的方法，该方法可以提高细菌转化效率，包括以下步骤：(1)将待转化质粒置于高温下一段时间使质粒变性；(2)立即冷却使目标质粒复性，此时非目标质粒无法及时复性；(3)对变性-复性处理的待转化质粒进行转化处理。在一些实施方案中，所述的质粒是指能够在细菌中自我复制的区别于细菌基因组的DNA环状双链。其形态有开环质粒和闭环质粒两种，开环质粒是指质粒双链中的一条或两条链在某处存在一处或多处共价断裂的情况，而闭环是指质粒的两条链全部都是完整的，不存在共价断裂。目标质粒是闭环质粒，非目标质粒是开环质粒。在一些实施方案中，所述的变性，是指质粒的两条链在一定条件下发生完全或部分分离的情况，这个条件包括高温、碱、去污剂等。在一些实施方案中，所述的高温，是指使DNA双链发生分离的温度，一般是在80-105摄氏度之间，特别是指98摄氏度。在一些实施方案中，所述的立即冷却，是指将高温处理过程中的转化质粒立即转移到低温介质中，这个介质包括低温的空气、水或油，特别是指温度低于10摄氏度的水。在一些实施方案中，所述的复性，是指两条DNA单链在碱基配对原则下重新生成DNA双链的过程。在一些实施方案中，所述的待转化质粒，是指含有环状DNA的溶液，一般是线性DNA在连接酶法或同源重组方式作用下形成的环状DNA分子溶液。待转化质粒中可能同时含有闭环质粒和开环质粒。在一些实施方案中，所述的转化，是指将环状DNA转入细菌细胞内的过程，包括但不限于化学转化和电转化。在一些实施方案中，所述的细菌是指原核生物，特别是指大肠杆菌。在一些实施方案中，所述的一段时间，是指1-30分钟，特别是指10分钟。附图说明通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本专利技术，其中：图1显示了线性DNA末端的3种形式。图2显示了几种不对称连接。具体实施方式本专利技术的目的是在开环质粒和闭环质粒的混合物中去除开环质粒。开环的质粒中至少存在一条链是不连续的，这使得在变性的条件下，质粒的两条链之间可以彻底分开，在溶液中处于游离状态。而闭环的质粒由于DNA双螺旋的特性，两条链之间的螺旋无法打开，即使在完全变性的条件下，两条链之间也更倾向于靠近彼此。当变性环境消失时，DNA单链之间又倾向于根据碱基匹配原则重新产生双螺旋，即复性。复性的时间与单链的浓度紧密相关，对于开环质粒，由于两条链之间已经彻底分离，其复性的时间会更长，而闭环的质粒，其两条链之间由于空间的原因，其等效浓度非常高，可以在很短的时间内复性。复性的程度还与变性条件的变化速度相关，变性条件缓慢变化时，比如温度缓慢下降或变性剂浓度缓慢下降时，复性程度较高。而温度快速下降或变性剂浓度快速下降时，复性程度较低，甚至绝大部分单链将处于局部稳态中，复性时间被极大延长。变性的程度也影响复性的速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用质粒转化细菌的方法，包括以下步骤：/n(1)将待转化质粒置于高温下一段时间使质粒变性；/n(2)立即冷却使目标质粒复性，此时非目标质粒无法及时复性；/n(3)用变性-复性处理的待转化质粒转化细菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种用质粒转化细菌的方法，包括以下步骤：
(1)将待转化质粒置于高温下一段时间使质粒变性；
(2)立即冷却使目标质粒复性，此时非目标质粒无法及时复性；
(3)用变性-复性处理的待转化质粒转化细菌。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述质粒是能够在细菌中自我复制的区别于细菌基因组的环状DNA双链，非目标质粒是开环质粒，目标质粒是闭环质粒，开环质粒是质粒双链中的一条或两条链在某处存在一处或多处共价断裂的质粒，闭环质粒是两条链全部都是完整的、不存在共价断裂的质粒。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性是使质粒的两条链在高温条件下发生完全或部分分离。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述高温是使质粒的DNA双链发生分离的温度；优选是80-105摄氏度之间；更优选是98摄氏度。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王洪琦，林继伟，
申请(专利权)人：华大青兰生物科技无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32