用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法技术

用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，该被引剂为核酸或核酸类似物，该方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将细胞暴露于该核酸或该核酸类似物的步骤，其中该核酸或该核酸类似物和该PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中该被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。

【技术实现步骤摘要】
用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/GB2012/052526，国际申请日是2012年10月11日，中国国家申请号为201280050149.X，进入中国的日期为2014年04月11日，专利技术名称为“方法”。本专利技术涉及用于促进试剂(agent)(例如核酸)进入细胞的方法和反应试剂(reagent)的领域。核酸和其类似物在基础研究以及预防性和治疗性干预中有许多应用。然而，原核和真核细胞对于核酸/类似物通常是不可渗透的。通常核酸/类似物的摄取需要病毒或非病毒递送载体，以激发它们的潜能(potential)。为了进行得有效，递送载体/核酸或类似物的组合或复合必须克服许多挑战，例如细胞外降解、细胞膜屏障的穿透(cellmembranebarrierpenetration)和胞内释放，同时使细胞毒性和抗原性最小化。许多原本很有用的多肽(例如蛋白质、肽)和其它生物活性分子也是细胞不可渗透的。例如许多化合物的活性在生化分析中比在细胞分析或活体内的活性要高。细胞活性的下降被认为是主要是由于向细胞内的递送不良。脂质转染胺(lipofectamine)是广泛使用的用于促进试剂(例如核酸)进入细胞的试剂的实例。然而，脂质转染胺被认为对特别是哺乳动物细胞有毒性作用，这可以例如使体外实验难以评价且活体内实验难以执行。其它被提出的促入剂(entry-promotingagent)描述在例如WO2009/015143(Biodegradablecationicpolymergenetransfercompositionsandmethodsofuse)；WO02/22174(作为生物相容性基因递送剂的阳离子脂质聚合物(cationiclipopolymerasbiocompatiblegenedeliveryagent))；WO2010/086406(非病毒转染剂)；US5,958,894(两亲性双胍衍生物)中。需要替代性的促进进入的试剂(促入剂)，用于例如核酸和其它物质，当活性受限于较差的细胞进入时。本专利技术识别出了促进进入的试剂和方法。这样的促进进入的试剂和方法被认为是有益于例如为特别是真核细胞提供良好的进入促进、较弱的抗原性、低成本和/或低毒性。这样的促进进入的试剂和方法可能例如在诸如以下等领域是有用的：核酸/类似物的转染，例如功能的研究；稳定细胞系的产生；基因沉默；和DNA疫苗。如本领域普通技术人员将容易理解的，这样的促入剂和方法可能在相关的RNA干扰(RNAi)或其它反义技术中是有用的。递送反应试剂或药物至细胞中的的挑战并不仅仅局限于核酸。蛋白质和肽通常也很难进入细胞，促入技术也是有用的。而且，许多被描述为小于1000克/摩尔的小分子也难以进入细胞，而通过改进的细胞递送技术将会提高它们作为试剂或药物的效用。PHMB(聚六亚甲基双胍)是已知的作为安全有效的杀生物剂(biocidalagent)，并被用作消毒剂(sanitiser)和防腐剂：US7897553、US4758595、US2008261841；US20040009144。本申请的专利技术者已经出人意料地发现PHMB和相关的分子是有用的促入剂。出人意料地观察到PHMB(举例)本身进入多种细胞，包括细菌、真菌和哺乳动物细胞。更出人意料地是，PHMB(举例)能够与多种分子形成纳米颗粒并将这些分子递送至这些细胞内。最后发现所递送的从核酸至小分子的分子在细胞内是能发挥作用的。在本说明书中明显的先前出版的文献的列出或论述不一定被认为是承认该文献是现有技术状态的部分或是公知常识。本专利技术的第一方面提供了用于促进试剂进入细胞的方法，所述方法包括在聚合物的存在下将所述细胞暴露于被引剂(introducedagent)的步骤，其中所述聚合物包括线型和/或支化聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物，例如根据下述式1a或式1b所示，在表1和表2中给出了实例，如下：式1a式1b其中：“n”指所述聚合物中的重复单元的数目，且n可以从2至1000、例如从2或5至10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900；G1和G2独立地表示包括双胍或胍的阳离子基团，其中L1和L2直接连接到所述胍的N原子。因此，所述双胍或胍基团是构成所述聚合物骨架所必需的。所述双胍或胍基团不是式1a的侧链部分。阳离子基团的实例：双胍(如在PHMB中)或胍(如在PHMG中)在本专利技术中，L1和L2是所述聚合物中的G1和G2阳离子基团之间的连接基团。L1和L2可以独立地表示包含C1-C140碳原子的脂肪族基团，例如烷基基团，诸如：亚甲基、乙烯、丙烯、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140烷基；或L1和L2可以(独立地)是C1-C140(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C-6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)脂环族、杂环、芳香族、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基，或L1和L2可以(独立地)是聚亚烷基，所述聚亚烷基可选地由一个或多个的优选为一个的氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断。合适的L1和L2的实例是表1中列出的基团。L1、L2、G1和G2可以使用脂肪族基、脂环族基、杂环基、芳基、烷基芳基、和氧化烯基进行改性。N和G3优选为端基。通常在本专利技术所使用的所述聚合物具有末端氨基(N)和氰基胍(G3)或胍(G3)端基。这样的末端基团可以(用例如1,6-二氨基己烷、1,6二(氰基胍基)己烷、1,6-二胍基己烷、4-胍基丁酸)通过连接到脂肪族基、脂环族杂环基、杂环基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基来改性。此外，端基可以通过连接到受体配体、葡聚糖、环糊精、脂肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇和胆固醇衍生物或聚乙二醇(PEG)来改性。可选地，所述聚合物可以用胍或双胍或氰胺或胺或氰基胍在N和G3位置，或氰胺在N且氰基胍在G3位置，或胍在N和氰基胍在G3位置，或L1胺在G3且氰基胍在N上终止。G3可以是L1-胺、L2-氰基胍或L2-胍。根据聚合(n)的数目或聚合物链的断裂和在合成过程中的副反应，端基的不均一(heterogeneous)混合物可以如以上所描述的作为实例出现。因此，N和G3基团可以是互换的(interchanged)/表现为不均一的混合物，如以上所指出的。或者N和G3可以是不存在的，且所述聚合物是环状的，在这种情况中，各自的末端L1和G2彼此直接连接。在式1b中，X可以是存在或不存在的。L3、L4和X是如上针对“L1或L2”所提到的。因此，L3和L4和X是所述聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，所述被引剂为核酸或核酸类似物，所述方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将所述细胞暴露于所述核酸或所述核酸类似物的步骤，其中所述核酸或所述核酸类似物和所述PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中所述被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。/n

【技术特征摘要】
20111011 GB 1117538.71.用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，所述被引剂为核酸或核酸类似物，所述方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将所述细胞暴露于所述核酸或所述核酸类似物的步骤，其中所述核酸或所述核酸类似物和所述PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中所述被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞。


3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞，例如组织或器官。


4.如权利要求1或3所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。


5.如权利要求1所述的方法，其中，所述被引剂包括分子量小于2000Da的小分子药物。


6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：利亚姆·古德，坎塔勒亚·金代亚，瓦伦蒂娜·格布尔契克，
申请(专利权)人：泰克里亚有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB