基于纳米载体的植物转染和转导制造技术

本发明专利技术提供用于转导和／或转染植物细胞的新方法。细胞穿透肽（ＣＰＰｓ）已被成功用作纳米载体，以将蛋白和寡核苷酸输送到单个植物细胞小孢子以及多细胞合子胚。通过合子胚的透化可以提高ＣＰＰ内化的效率以及包括蛋白和／或寡核苷酸的大分子载荷的进一步输送。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用细胞穿透肽转化植物的新方法和组合物。
技术介绍
开发展示特定性状的植物新品系的传统植物育种策略是耗费时间的，并且有时是无法预见的。近年来，植物遗传转化和生长鉴定方法以及有用基因及其产物的提供的发展 使快速开发表达目标性状的植物成为可能。但是，仍然需要改进的方法。现有策略，诸如 农杆菌介导的转化和粒子轰击(particle bombardment)严重依赖于组织和基因型。细 胞穿透肽(CPPs)是一类新的并且快速增长的短肽，已知其在哺乳动物和人细胞系各种各 样的载荷复合物(cargo complexes)(包括蛋白和DNA)穿过生物膜的转运中起重要作用 (Schwartz and Zhang, 2000 ；Langel，2002 ；Vives,2002,)。HIV-ITAT蛋白转导结构域(PTD)是研究最彻底的转运肽。最近的报道显示 TAT-PTD及其寡聚体用于质粒输送的可能性，其通过与带负电荷的DNA在哺乳动物细胞中 形成复合物(Ignatovich et al,2003 ；Rudolph e al,2003 ；Siprashvili et al，2003; Hellgren et al，2004)。其他被证明具有转运特性的肽包括pVEC，运送子(transportan)， 穿透子(penetratin)，pep-Ι肽及其片段。关于CPP介导的转运的一些现有技术将在下文描述。美国专利申请20040121325 描述了一种产生重组植物或植物细胞的方法，所述重组植物或植物细胞表达编码具有木糖 基转运酶活性的蛋白的序列或与其互补的序列。PCT申请W02005117992公开了一种用于将化合物受控输送入靶细胞的组合物。所 述组合物包括细胞穿透肽，细胞穿透肽抑制剂，化合物，和切割位点，其中所述肽抑制剂抑 制细胞穿透肽的转运活性。切割剂在切割位点的切割解除对细胞穿透肽的抑制，然后解除 抑制的细胞穿透肽能够将化合物转运入靶细胞。但是，该申请没有公开植物细胞转化。美国专利申请号2005/0260756公开了一种用于促进将双链RNA分子输送入细胞 的膜可渗透复合物。所述复合物包括双链RNA分子和细胞穿透肽，其中双链RNA与细胞穿 透肽通过共价键连接。所述公开内容限于神经元细胞的转化。Urmamalai等(FEBS Letters 566(2004)307)公开了使用阳离子寡肽聚精氨酸输 送用于转录后基因沉默的dsRNA。尽管已经证明CPPs促进在哺乳动物细胞中的载荷输送，但是在植物细胞中使用 CPP进行转染研究受到许多因素的限制。对植物采用这种技术的主要障碍是，与动物细胞不 同，对于CPPs及其载荷的内化来说，植物细胞存在双重屏障系统(细胞壁和质膜)。因此， 为了有效转运，CPPs必须克服这两个屏障。随着来自植物基因组测序项目的信息不断增加，急需开发一种用于植物的快速、 通用(不依赖组织/基因型)方法，以便对大量基因进行功能基因组研究和开发表达目标 性状的转基因植物。专利技术概述本专利技术解决了对将基因和/或蛋白输送到植物细胞的新方法的需要。使用细胞穿透肽将目标载荷输送到植物细胞内部。在本专利技术的一个方面，提供将载荷部分输送到植物细胞的方法。所述方法包括将 植物细胞暴露于复合物，所述复合物包含与载体部分连接的至少一个载荷部分。植物细胞 优选的是体细胞或配子体细胞。在一个优选 的实施方案中，载体部分是具有细胞穿透和核酸结合特性的多肽。在 又一优选的实施方案中，载体部分包含核定位信号。载体部分可以选自HIV tat，pVEC，运送子，穿透子，P印-1肽及其片段。其他具有 细胞穿透特性的载体也可用于本专利技术的方法。在优选的实施方案中，载体部分包含tat的 蛋白转导结构域(PTD)或其片段，优选的为HIV tat的氨基酸49到57。在本专利技术的一个方面，载荷部分包括核酸。核酸可以包括1^嫩31111 嫩31 嫩，沙嫩， siRNA, shRNA, PNA, ssRNA, dsRNA, ssDNA, dsDNA, DNA =RNA 杂合体；质粒，人工染色体,基因 治疗构建体，cDNA, PCR产物，限制性片段，核酶，反义构建体或其组合。在优选的实施方案 中，核酸是DNA。在另一优选的实施方案中，核酸是RNA。在本专利技术的另一方面，载荷部分是多肽。在一优选的实施方案中，多肽编码改变细 胞代谢的蛋白。所述蛋白可以是胚胎发生相关蛋白或其活性结构域。所述蛋白可以是与同 源重组有关的多肽或其活性结构域。在本专利技术的可选择方面，载荷部分还包括其他多肽和/或核酸的组合。在本专利技术优选的实施方案中，用细胞透化剂预处理植物体细胞以促进复合物的内 化。优选的透化剂是甲苯。除本专利技术的方法之外，本专利技术还提供用于介导活性物质输送入植物细胞的复合 物。所述复合物包括与载体部分连接的载荷部分，其中所述载体部分可以驱动所述复合物 进入植物细胞。在优选的实施方案中，载荷部分是核酸，并且载体部分包括核定位信号。在另一实 施方案中，复合物包括由载荷部分和载体部分组成的融合蛋白。可以包括标记蛋白以追踪 复合物的内化。所述复合物中还可以包括多种其他类型的蛋白，诸如与定点整合有关的蛋 白或胚胎发生蛋白或其活性结构域。在另一优选的实施方案中，所述方法包括添加转染剂，诸如lipofectamine。本专利技术还提供利用本专利技术的方法和构建体产生的转基因植物种子和分离的植物 细胞。附图简述根据下列说明(参考附图)，本专利技术的这些和其他特征将更清楚，其中附图说明图1显示根据本专利技术的实施方案，透化作用对荧光标记的复合物转运的影响；图2显示小孢子中Tat的摄取；图3显示透化胚胎中多种CPPs的功效；图4显示透化胚胎中Tat-GUS复合物的摄取；图5显示透化胚胎中Tat2_GUS复合物的摄取；图6显示透化胚胎中P印-I-GUS复合物的摄取；图7显示小孢子中P印-I-GUS复合物的摄取；图8显示透化胚胎中gus基因的表达；图9显示来自Tat-DNA复合物处理的小孢子的植物；和图10显示lipofectamine对gus基因表达的影响。图11A显示CPPs和DNA不同处理的影响。图11B显示DNA和RecA不同组合的影响。详细说明将外源核酸或多肽输送穿过植物细胞的细胞进入屏障是困难的。可以通过用细胞 透化剂诸如甲苯处理植物组织来提高成功的机会(Mahalakshmi et al,2000)；但是，转化 率仍然较低。本专利技术提供将载荷输送到植物细胞的新方法。所述载荷可以是将在靶细胞中表达 的核酸分子或其可以是多肽。所述载荷可以包括标记物以追踪进入植物细胞的输送。在本专利技术的方法中，载荷与细胞穿透肽(CPP)连接，在本文中CPP还被称为“载体” 或“载体部分”。所述载体与载荷复合，然后将载荷输入细胞。简单来说，制备包括载体部分和载荷部分的复合物。载体部分是可以横穿植物细 胞膜和/或细胞壁的试剂。用于本专利技术优选的载体是细胞穿透肽(CPP)。可用于本专利技术方法和复合物的CPPs 包括，但不限于HIV tat, pVEC,运送子，穿透子，Pep-1及其片段。载荷部分可以是核酸或多肽。可以与载体偶联的核酸实例包括mRNA，tm RNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, PNA, s本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于将载荷部分输送到植物组织、器官或细胞的方法，所述方法包括将植物细胞暴露于包含与载体部分连接的至少一个载荷部分的复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗索瓦艾乌蒂斯，阿查纳丘格，
申请(专利权)人：加拿大农业及农业食品部，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]