一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建制造技术

本发明专利技术提出了一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建，利用腺病毒穿梭载体pShuttle为基础质粒，在多克隆位点上利用限制性核酸内切酶KpnI和Bgl II插入内部核糖体进入位点元件序列，从而构建了一个包含双顺反子序列并携带有两个并行的多克隆位点的用于腺病毒载体构建的真核表达穿梭载体。通过PCR扩增和基因测序证实该载体构建成功；该载体可用于双基因或多基因的真核表达和相应腺病毒载体的构建等实验研究，为基因功能研究提供了便利。

【技术实现步骤摘要】
一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建
本专利技术属于腺病毒载体的构建领域，涉及一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建。
技术介绍
近年来，具有多种基因的基因治疗已受到高度重视，在基因功能研究中，为了研究基因的特征、蛋白的生化特性及其功能机制，通常也需要构建双基因或多基因表达载体；但是，目前尚没有构建多个顺反子的有效工具。以人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,CMV)、猿猴病毒40(Simianvirus,SV40)、人的延伸因子1α亚基(Humanelongationfactor1αsubunit，EF-1α)等启动子为基础的真核表达载体以及逆转录病毒载体被广泛应用于外源基因的转导和表达，尤其在作为基因疫苗和基因治疗载体的方面应用更为广泛。这些载体往往是表达双基因载体(Doublegenevector)。但这两个基因往往转录表达效率不高，甚至导致目的基因表达水平很低，其原因是这两个启动子都是真核启动子，转录起始存在竞争干扰现象；结果导致双基因载体没有单基因载体(Singlegenevector)表达水平高。针对这个问题，一些载体被改善设计，例如自我失活载体(Self-inactivatingvector)和U3为基础的载体(U3-basedvector)等，但问题解决得并不理想。
技术实现思路
本专利技术提出了一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建，依据双顺反子理论，对腺病毒穿梭载体进行改造设计，插入内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite,IRES)元件，得到可用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭载体pShuttle-MCSA-IRES-MCSB，解决了转录起始存在竞争干扰的困难，从而解决了构建两个顺反子的真核表达载体转录表达效率不高的问题。为解决技术问题，本专利技术的技术方案为：一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒，基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。上述一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒构建，步骤如下：（1）引物设计与合成根据pIRES的基因序列，设计两条扩增IRES的引物，上游引物（IRES-F）：5’tagcgcgtaatactggtacctcaatattggccattagc3’，下游引物（IRES-R）:5’aaccacgcccagatctgtttattgcagcttataa3’，下划线序列分别代表KpnI和BglII酶切位点；（2）IRES的扩增与克隆①以pIRES为模板，IRES-F和IRES-R为引物，扩增IRES片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；②pShuttle经KpnI/BglII酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；③利用HieffClone®PlusOneStepCloningKit一步法快速克隆试剂盒，将酶切后的载体与PCR扩增得到的IRES片段进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，50℃反应20min后进行转化，完成定向克隆；阳性克隆的鉴定采用酶切及测序进行鉴定，得到重组载体pShuttle-IRES。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用腺病毒穿梭载体pShuttle为基础质粒，在多克隆位点上利用限制性核酸内切酶KpnI和BglII插入内部核糖体进入位点元件序列，从而构建了一个包含双顺反子序列并携带有两个并行的多克隆位点的用于腺病毒载体构建的真核表达穿梭载体pShuttle-MCSA-IRES-MCSB，；通过PCR扩增和基因测序证实该载体构建成功，成功解决了转录起始存在竞争干扰的困难，达到了两个顺反子的真核表达载体转录表达效率高的目的，为基础和临床研究应用腺病毒载体进行双基因或多基因的试验或治疗提供了强有力的工具。在腺病毒穿梭载体多克隆位点区域插入IRES元件，得到可用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭载体pShuttle-MCSA-IRES-MCSB，实现了多个基因在同一载体上的“同时转录，独立翻译”，解决了基因功能研究中双基因或多基因真核表达的问题，为基础和临床研究应用腺病毒载体进行双基因或多基因的试验或治疗提供了强有力的工具。附图说明图1是本专利技术中重组载体pShuttle-IRES的构建流程图。图2是PCR扩增IRES的琼脂糖凝胶电泳结构。图3是重组质粒pShuttle-IRES的双酶切鉴定结构。图4是本专利技术涉及的重组质粒测序结果BLAST比对分析图。具体实施方式一、本专利技术中涉及的材料说明1、载体和菌株腺病毒穿梭载体pShuttle购自艾礼生物科技（上海）有限公司（Agilent，GenBank序列号：AF334399），pIRES购自大连宝生物科技有限公司(Clontech),宿主菌Ecoli.DH5α为本实验室保存。2、试剂与酶聚合酶Advantage2PCRKit（Clontech，Cat.639207）购自大连宝生物工程公司，一步法快速克隆试剂盒HieffClone®PlusOneStepCloningKit、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司；各种限制性内切酶均购自ThermoFisher公司。二、根据上述材料，进一步描述本专利技术一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒构建，参见图1所示，步骤如下：（1）引物设计与合成根据pIRES的基因序列，设计两条扩增IRES（1-1910bp）的引物，上游引物（IRES-F）为’tagcgcgtaatactggtacctcaatattggccattagc3’，下游引物（IRES-R）为5’aaccacgcccagatctgtttattgcagcttataa3’，下划线序列分别代表KpnI和BglII酶切位点；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成；（2）IRES的扩增与克隆①以pIRES为模板，IRES-F和IRES-R为引物，扩增IRES片段；扩增条件为95°Cfor1min，95°Cfor15sec，68°Cfor3min，30cycles；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；②pShuttle经KpnI/BglII酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；③利用HieffClone®PlusOneStepCloningKit一步法快速克隆试剂盒，将酶切后的载体与PCR扩增得到的IRES（1910bp）片段进行定向克隆，PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，50℃反应20min后进行转化，完成定向克隆。阳性克隆的鉴定采用酶切及测序进行鉴定。得到重组载体pShuttle-IRES，见序列表。三、本专利技术中涉及的鉴定方法及结果IRES的扩增与克隆中，成功扩增出了约2.0kb的核苷酸序列，见图2；通过KpnI/BglII酶切鉴定重组质粒p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒，基因序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒，基因序列如序列表中SEQIDNO：1所示。


2.一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒构建，步骤如下：
（1）引物设计与合成
根据pIRES的基因序列，设计两条扩增IRES的引物，上游引物（IRES-F）：5’tagcgcgtaatactggtacctcaatattggccattagc3’，下游引物（IRES-R）:5’aaccacgcccagatctgtttattgcagcttataa3’，下划线序列分别代表KpnI和BglII酶切位点；
（2）IRES的扩增与克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家宁，
申请(专利权)人：十堰市人民医院湖北医药学院附属人民医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42