外源基因可控表达的腺病毒包装方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装载体。该方法所采用的腺病毒包装载体具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。本发明专利技术创造性的将阻遏型操作子整合到腺病毒载体中，可以降低病毒包装过程中外源基因表达，从而排除外源基因的影响，提升特定病毒的产量。

【技术实现步骤摘要】
外源基因可控表达的腺病毒包装方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装方法。
技术介绍
病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有高亲和性结合细胞表面受体，并传送其基因组进入某些类型细胞，进行感染的分子机制。广泛应用于基础研究、基因疗法或疫苗。腺病毒特别适于用作病毒载体。腺病毒是无包膜病毒，直径约90nm～100nm，包含核衣壳和线性双链DNA基因组。病毒核衣壳包含五邻体衣壳体和六邻体衣壳体。一种独特的纤维与各五邻体基质相关，并且帮助病毒经由宿主细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒受体而附着到宿主细胞上。已识别出超过50种的腺病毒血清型菌株，其中大多数引起人类的呼吸道感染、结膜炎和胃肠炎。腺病毒通常作为宿主细胞核中的游离基因成分复制，而不是整合到宿主基因组中。腺病毒的基因组包含4个早期转录单位(E1、E2、E3和E4)，其主要具有调节功能，并为宿主细胞复制病毒作准备。基因组还包含5个晚期转录单位(L1、L2、L3、L4和L5)，其转录包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、支架蛋白(L4)和纤维蛋白(L5)在内的结构蛋白，其中结构蛋白受单个启动子的控制。基因组的每一末端都包含病毒复制所必需的末端反向重复(ITR)序列。目前病毒载体的研究都集中在感染能力、特异性、包装容量等方面，而对于包装的外源基因(geneofinterest，GOI)对于病毒的影响关注很少，在实践中，有相当一部分外源基因是无法获得有效的病毒颗粒。这是因为，在病毒包装过程中，一方面，外源基因通常由强启动子驱动，其表达对细胞状态，病毒的包装，出毒等过程都有无法预料的影响。
技术实现思路
本专利技术涉及一种腺病毒包装载体，具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及一种腺病毒包装载体系统，其包括如上所述的腺病毒包装载体以及框架载体。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及一种腺病毒的包装方法，所述方法将包含如上所述的腺病毒包装载体系统转入宿主细胞，并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：无需判断外源基因是否对腺病毒产生影响，因为没有阻遏物的时候，阻遏系统不会发挥作用，也不会影响目的基因的表达。当发现出毒明显低于平均水平的时候，配合包含阻遏蛋白表达的辅助质粒即可进行抑制外源基因的病毒包装过程，从而排除外源基因的影响，提升特定病毒的产量，无需重新构建新的穿梭载体，节省了大量的时间以及人力和物力。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1～图5依次为本专利技术一个实施例中pcDNA3.1-CymR、CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO载体的质粒图谱；图6为本专利技术一个实施例中CymR-CuO在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图7为本专利技术一个实施例中CMV-TrpO质粒图谱；图8为本专利技术一个实施例中色氨酸操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图9为本专利技术一个实施例中EF1a-ToxO质粒图谱；图10为本专利技术一个实施例中白喉毒素抑制子调控系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图11为本专利技术一个实施例中SFH-LacO质粒图谱；图12为本专利技术一个实施例中乳糖操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；图13为本专利技术一个实施例中TrpO元件相对于CMV的TATABox的插入位置示意图；图14为本专利技术一个实施例中TrpO元件不同插入位置对阻遏效率的影响；图15为本专利技术一个实施例中CuO元件相对于CMV的TATABox的插入位置示意图；图16为本专利技术一个实施例中CuO元件不同插入位置对阻遏效率的影响；图17为本专利技术一个实施例中腺病毒载体表达CMV-NLS-iCre基因的荧光结果图；图18为本专利技术一个实施例中腺病毒载体表达CMV-NLS-iCre基因的滴度检测结果；图19～图21依次为本专利技术一个实施例中pShuttle-CMV-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP、pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP和pShuttle-CMV-CuO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP的质粒图谱。图22为本专利技术原理示意图。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本专利技术更广阔的方面。本专利技术涉及一种腺病毒包装载体，具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。本专利技术通过阻遏型操作子使得目的基因的表达可被调控，从而实现选择性地抑制外源基因在腺病毒包装细胞中的表达，避免外源基因对腺病毒包装与生产的负面影响，提高病毒的生产效率和滴度，同时在靶细胞中不降低外源基因的表达水平，不影响治疗效果或研究外源基因的功能。在本专利技术中术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体优选为质粒。在一些实施方式中，所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。在一些实施方式中，所述阻遏型操作子具有一个或多个拷贝。在一些实施方式中，所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATABOX小于等于18个核苷酸，例如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸。在一些实施方式中，所述Cumate-CuO可调控系统中的CuO元件的插入位置距离所述启动子的TATABOX40～50个核苷酸，例如41、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺病毒包装载体，具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；/n所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；/n当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种腺病毒包装载体，具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；
当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。


2.根据权利要求1所述的腺病毒包装载体，所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。


3.根据权利要求2所述的腺病毒包装载体，所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATABOX小于等于18个核苷酸。


4.根据权利要求2所述的腺病毒包装载体，所述Cumate-CuO可调控系统中的CuO元件的插入位置距离所述启动子的TATABOX40～50个核苷酸。


5.根据权利要求1所述的腺病毒包装载体，所述启动子为CMV、EF1a、SFH、CAG、CBh、UBC、SFFV、SV40、RSV、mCMV、GAPDH、PGK、CASI、SMVP、GUSB或UCOE。


6.根据权利要求1～5任一项所述的腺病毒包装载体，所述阻遏型操作子下游插入有目的基因；
且当所述目的基因表达时会对病毒包装产生负面影响。


7.根据权利要求6所述的腺病毒包装载体，所述目的基因对包装细胞产生细胞毒性。


8.根据权利要求7所述的腺病毒包装载体，所述目的基因选自自杀基因、细胞凋亡基因(例如小鼠caspase8基因)和癌基因。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴林，杨佳丽，杨蕊菊，贾国栋，由庆睿，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31