一种人γ-干扰素病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人γ‑干扰素病毒载体及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术采用改造后的人γ‑干扰素序列制备人γ‑干扰素病毒载体，所述的人γ‑干扰素病毒载体具有更好的表达活性及生物学活性，可用于病毒性疾病、肿瘤等疾病的治疗和/或预防，为病毒性疾病、肿瘤等疾病的治疗和/或预防提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种人γ-干扰素病毒载体及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种人γ-干扰素病毒载体及其应用。
技术介绍
干扰素(interferons，IFNs)是多功能细胞因子家族成员之一，是一类高活性、多功能的分泌型糖蛋白，具有抗增殖、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等作用。根据其基因序列、染色体定位和受体特异性等特点可分为I型、II型和III型IFNs。其中，II型干扰素只有1种，即IFNγ。IFNγ的细胞表面受体为IFNGR(interferongammareceptor)，由IFNGR1和IFNGR2两个亚基组成。IFNγ主要由浆细胞样树突细胞(plasmacytoiddendriticcells，pDC)生成。在抗肿瘤方面发挥重要作用的为I型和II型IFNs，而II型IFNs相比于I型IFNs毒副作用较小，在抗病毒和抗肿瘤方面具有更广泛的应用前景。IFNγ主要通过与细胞表面受体的结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用，其抗病毒作用是非特异性的。IFNγ主要的效应分子有双链RNA依赖的蛋白激酶R(Double-strandedRNAdependentproteinkinase，PKR)、Mx、2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’OAS)/核糖核酸酶L(RNaseL)系统等。PKR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在与dsRNA结合后被激活，活化的PKR可使蛋白合成起始因子eIF-2及核因子抑制因子IkB磷酸化，从而抑制病毒和细胞蛋白的合成，起到抗病毒的作用；Mx能够通过干扰某些负链病毒核酸片段向细胞内转运及某些病毒蛋白的功能而抑制病毒的增殖；2’-5’寡腺苷酸合成酶能够使ATP聚合为2’-5’寡腺苷酸，激活核糖核酸酶L降解ssRNA，从而干扰病毒复制。近年来还发现一些其他的干扰素诱导基因(Interferon-stimulatedgenes，ISGs)，如p56、p54、phospholipidscramblase1、TRAIL/APO2L、ISG12、GBP1、ISG20、XAF1、NOS等，它们通过不同的抗病毒机制而发挥抗病毒作用，如NOS使半胱氨酸、酪氨酸亚硝基化，从而干扰病毒蛋白二硫键的形成；ISG20能够特异性地降解病毒RNA。在诱导效应因子表达的同时，由于IFNγ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFNγ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。另一方面，IFNγ还能够通过多种机制发挥复杂的抗肿瘤作用，比如①通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，发挥直接的抗肿瘤作用；②通过抑制肿瘤血管生成，发挥间接的抗肿瘤作用；③通过激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞，发挥间接的抗肿瘤作用。专利CN1552850A公开了一种重组人γ-干扰素腺病毒，通过基因重组技术使人γ-干扰素基因与腺病毒载体发生重组，利用复制缺陷型腺病毒载体将γ-干扰素引入机体组织细胞使人γ-干扰素蛋白在体内稳定表达，但所述重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒作用较弱。专利CN108064176A公开了一种用于治疗肿瘤疾病的含有RNA的组合物，所述的含有RNA的组合物包括γ-干扰素。因此，亟需开发一种抗病毒与肿瘤治疗效果更好的人γ-干扰素病毒载体。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种人γ-干扰素病毒载体及其应用。本专利技术通过对人γ-干扰素序列进行优化，制备人γ-干扰素病毒载体，提升了其抗病毒与抗肿瘤的功能，从而更好的预防和/或治疗相关疾病。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种人γ-干扰素病毒载体，所述的人γ-干扰素病毒载体包括病毒载体和融合基因。具体地，所述的融合基因包括信号肽和人γ-干扰素核心结构域，所述的信号肽和人γ-干扰素核心结构域串联。进一步具体地，所述的信号肽为分泌型蛋白的信号肽。优选地，所述的信号肽为tPA信号肽、IL-2信号肽、IFN-γ信号肽、TGF-β信号肽、GM-CSF信号肽、CD5信号肽或MIgG2a信号肽中的一种或多种，进一步优选为tPA信号肽，所述的tPA信号肽序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。进一步具体地，所述的人γ-干扰素核心结构域为人γ-干扰素功能区域的截短体(第24-157号氨基酸)，所述的人γ-干扰素核心结构域的序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。进一步具体地，所述的融合基因序列经密码子偏好性、5'区域、DNA重复序列、mRNA二级结构、GC含量、SD序列等参数优化后得到，所述的融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的序列。具体地，所述的病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。进一步具体地，所述的腺病毒载体为缺失型腺病毒载体，优选为辅助病毒载体，所述的辅助病毒载体移除了所有的腺病毒基因，仅仅保留了病毒基因的ITR和包装信号，显著降低其免疫原性，安全性更高。本专利技术所述的病毒载体不仅限于上述所列举的载体，能够用于基因递送的病毒载体均可应用于本专利技术。另一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含上述人γ-干扰素病毒载体。具体地，所述的宿主细胞为细菌、酵母或动物细胞。又一方面，本专利技术提供了一种抗病毒或抗肿瘤产品，所述的抗病毒或抗肿瘤产品包含上述人γ-干扰素病毒载体或宿主细胞。具体地，所述的病毒包括但不限于乙肝病毒、丙肝病毒或水疱性口炎病毒，优选为水疱性口炎病毒。具体地，所述的肿瘤包括但不限于前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、鼻咽癌、舌癌、喉癌、甲状腺癌、膀胱癌、睾丸癌、头颈癌、骨肉瘤、皮肤癌、间皮瘤、软组织肉瘤、宫颈癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或肾细胞癌，优选为肝癌。具体地，所述的产品为独立试剂、试剂盒、疫苗、药物或药物组合物。进一步具体地，所述的药物或药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。又一方面，本专利技术提供了上述人γ-干扰素病毒载体或宿主细胞在制备抗病毒或抗肿瘤产品中的应用。在某些实施例中，本专利技术通过将改造后的人γ-干扰素的表达元件导入到病毒载体中，携带人γ-干扰素的病毒载体感染宿主细胞并在细胞内表达人γ-干扰素，从而达到杀伤病毒及抑制肿瘤的作用。在某些实施例中，本专利技术中携带改造后人γ-干扰素表达元件的腺病毒载体在以MOI100感染细胞72小时后，表达量约为150.51ng/mL，且用细胞病变抑制法检测细胞上清中γ-干扰素的效价，约为8014IU/mL。同等条件下，携带野生型人γ-干扰素的腺病毒载体在细胞中72小时的表达量约为64.43ng/mL，生物学效价约为2013I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人γ-干扰素病毒载体，其特征在于，所述的人γ-干扰素病毒载体包括病毒载体和融合基因；/n所述的融合基因包括信号肽和人γ-干扰素核心结构域，所述的信号肽和人γ-干扰素核心结构域串联；/n所述的信号肽为分泌型蛋白的信号肽，所述的分泌型蛋白的信号肽为tPA信号肽、IL-2信号肽、IFN-γ信号肽、TGF-β信号肽、GM-CSF信号肽、CD5信号肽或MIgG2a信号肽中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种人γ-干扰素病毒载体，其特征在于，所述的人γ-干扰素病毒载体包括病毒载体和融合基因；
所述的融合基因包括信号肽和人γ-干扰素核心结构域，所述的信号肽和人γ-干扰素核心结构域串联；
所述的信号肽为分泌型蛋白的信号肽，所述的分泌型蛋白的信号肽为tPA信号肽、IL-2信号肽、IFN-γ信号肽、TGF-β信号肽、GM-CSF信号肽、CD5信号肽或MIgG2a信号肽中的一种或多种。


2.根据权利要求1所述的人γ-干扰素病毒载体，其特征在于：
所述的分泌型蛋白的信号肽为tPA信号肽，所述的tPA信号肽序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
所述的人γ-干扰素核心结构域为人γ-干扰素功能区域的截短体第24-157号氨基酸，所述的人γ-干扰素核心结构域的序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求2所述的人γ-干扰素病毒载体，其特征在于：所述的融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的序列。


4.根据权利要求3所述的人γ-干扰素病毒载体，其特征在于：所述的病毒载体为腺病毒载体、腺相关...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文林，田烁，周晓鸿，
申请(专利权)人：广州达博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44