【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程药物领域，具体涉及一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法及应用。
技术介绍
1、溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，可以通过细胞表面受体分子入侵到肿瘤细胞中，具有肿瘤治疗潜力。现有溶瘤病毒治疗的有效策略是改造出具有特异性的溶瘤病毒，并靶向肿瘤细胞中过度表达的特异性受体，将病毒入侵到肿瘤细胞中并行使后续的各项功能。
2、溶瘤病毒介导的基因治疗对肿瘤细胞杀伤效率高、特异性好、安全性高、副作用小、成本低廉，是一种新兴肿瘤免疫治疗模式。但溶瘤病毒疗法并非十全十美，目前其最大的挑战，依然在于如何提高产品的安全性和有效性。
3、申请号为201010621084.2的中国专利中公开了一种人工改造人类5型腺病毒(ad5)的构建方案，以及用该方案获取的一种新型溶瘤腺病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途，属于医学基因工程
用pcr扩增定点缺失、酶切、连接、克隆、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得的一种重组腺病毒构建体，特征在于：ad5基因组e1a保守序列2(cr2)区缺失27个碱基；e3区adp基因的29477-29714nt缺失；同时在该缺失区插入hsv-tk基因的全长编码序列(1131bp)。该构建体是一种具有更高的肿瘤选择性复制能力的新型溶瘤腺病毒载体，其利用hsv-tk的自杀基因作用和溶瘤病毒溶解肿瘤细胞的双重杀伤效应在肿瘤的生物治疗中具有独特的实用价值。但其肿瘤杀伤能力有限。
4、申请号为201910462073.5的中国专利中公开了：重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术利用admax复制缺陷型的ad5型腺病毒载体进行基因工程改造，获得一款利用多重机制提高溶瘤病毒安全性和有效性的溶瘤病毒。
2、本专利技术对腺病毒骨架载体(以pbhgloxδe1,3cre为例)和穿梭载体(以pdc316为例)分别进行了改构，并利用改构后的两种载体共转染表达细胞(以293细胞为例)以制备溶瘤腺病毒。
3、admax系统的骨架载体pbhgloxδe1,3cre缺失了ad5型腺病毒的e1基因和e3基因，所以和穿梭载体如pdc316共转染293细胞制备的腺病毒不具有复制能力，即丢失了溶瘤病毒的特征。通过下面的改造，本专利技术恢复了病毒的复制能力，并且增强了溶瘤病毒在肿瘤杀伤作用中的高效性和安全性。
4、一方面，本专利技术提供了一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法。
5、所述构建方法中包括：
6、(1)在穿梭载体插入htert启动子、e1a基因区、55kd e1b相关片段和p53基因构建得到改造穿梭载体，其中：所述e1a基因区为缺少cr2区片段的e1a基因；所述55kd e1b相关片段包括缺失19kd片段的e1b基因和e1b基因启动子区，所述的缺失19kd片段的e1b基因为seq id no.1；
7、(2)对e1和e3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造得到改造腺病毒载体：
8、将ad5腺病毒fiber分子上的knob和shaft序列替换成ad35型腺病毒上的knob和shaft序列；并将hgm-csf基因插入骨架载体的e3缺失区；
9、(3)改造穿梭载体和改造腺病毒载体共转染细胞后表达。
10、具体地，所述的步骤(1)中：
11、所述的htert启动子为seq id no.2；
12、所述的cr2区片段为seq id no.3；
13、所述的e1b基因启动子区为seq id no.4；
14、所述的p53基因区序列为seq id no.5。
15、优选地，所述的步骤(1)中：e1a基因区为seq id no.6。
16、优选地，所述的步骤(1)中：穿梭载体为pdc316。实际上，本领域技术人员对于穿梭载体的选择不局限于本专利技术所优选的类型，能够实现穿梭载体功能的均可。
17、所述的步骤(2)中ad35型腺病毒上的knob和shaft序列为seq id no.7。
18、所述的步骤(2)中hgm-csf基因为seq id no.8。
19、步骤(2)中对e1和e3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括：
20、1)构建含cre酶识别位点、抗性筛选标记、ad35型病毒fiber基因上的knob和shaft功能区的载体，并通过抗性筛选获得阳性克隆；
21、2)利用表达cre重组酶的大肠杆菌进行同源重组，将添加的筛选标记敲除；
22、3)将hgm-csf基因插入骨架载体的e3缺失区。
23、所述的步骤1)中：抗性筛选标记包括抗性基因和启动子；所述的cre酶识别位点为loxp位点。
24、优选地，所述的步骤1)中：loxp序列为seq id no.9所示。
25、所述的步骤3)中：hgm-csf基因与ad5骨架序列共同插入，插入酶切位点为paci。
26、在一些实施例中，所述的步骤(1)对穿梭载体进行的改构可以包括以下步骤：
27、插入人端粒酶逆转录酶htert启动子区和受其调控的e1a基因区，序列分别如seqid no.2和seq id no.6所示；
28、插入受e1a调控的缺失19kd e1b基因及e1b基因启动子区，即55kd e1b相关片段；序列为seq id no.4-seq id no.1(表示二者连接)；
29、通过同源重组缺失e1a基因上cr2区段(24bp序列)；cr2区段如seq id no.3所示；
30、在载体多克隆位点插入p53基因。具体的序列为seq id no.5所示。
31、以上改造方式的作用在于：
32、(1)利用肿瘤特异性启动子来特异性表达e1a基因以及利用e1a基因缺失24bp序列的蛋白不能和rb分子结合的特点，进一步增强了溶瘤病毒在肿瘤细胞的特异性复制能力；
33、(2)通过缺失e1b基因的19kd分子，增强了溶瘤病毒诱导肿瘤细胞发生凋亡。
34、本专利技术的穿梭载体还包括：
35、在多克隆位点上插入了p53基因。p53是一种肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。在肿瘤细胞中过表达野生型p53能够阻滞肿瘤细胞周期本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的hTERT启动子为SEQ ID NO.2；所述的CR2区片段为SEQ ID NO.3；所述的p53基因区序列为SEQ IDNO.5。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)中E1A基因区为SEQ IDNO.6。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述所述的步骤(1)中穿梭载体为pDC316。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中Ad35型腺病毒上的Knob和Shaft序列为SEQ ID NO.7。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中hGM-CSF基因为SEQID NO.8。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中对E1和E3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括：
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1)中：抗性筛选标记包括抗性基因和启
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤3)中：hGM-CSF基因与AD5骨架序列共同插入，插入酶切位点为PacI。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1)中：LoxP序列为SEQ IDNO.9所示。
11.权利要求1-10任一项所述的构建方法构建的多靶点溶瘤腺病毒。
12.权利要求11所述的多靶点溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤，包括乳腺癌、肝癌、胆囊癌、胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、大肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌或头颈癌。
14.含权利要求11所述的多靶点溶瘤腺病毒的抗肿瘤药物。
...【技术特征摘要】
1.一种多靶点溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的htert启动子为seq id no.2；所述的cr2区片段为seq id no.3；所述的p53基因区序列为seq idno.5。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)中e1a基因区为seq idno.6。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述所述的步骤(1)中穿梭载体为pdc316。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中ad35型腺病毒上的knob和shaft序列为seq id no.7。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中hgm-csf基因为seqid no.8。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中对e1和e3区缺失的腺病毒的骨架载体进行改造的步骤包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：王健，刘奇，程彤，陈剑花，田烁，黄文林，
申请(专利权)人：广州达博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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