一种基于制造技术

本发明专利技术提供了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于Cre重组酶的人腺病毒HAd5C改造方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于
Cre
重组酶的人腺病毒
HAd5C
改造方法
。

技术介绍

[0002]腺病毒是从呼吸道感染的婴儿扁桃体腺中分离培养得到，可分为
A
‑
G
七个种，超过
100
个血清型
。
人腺病毒
(Human adenovirus
，
HAdV)
属于腺病毒科
(Adenoviridae)
哺乳动物腺病毒属
(Mastadenovirus)。
腺病毒具有外源基因较大的装载容量，因此腺病毒可作为基因表达载体，被广泛应用于基因治疗和病毒溶瘤等方面
。
腺病毒也是疫苗开发中常采用的载体，以5亚型腺病毒载体居多
。
[0003]腺病毒属线性双链
DNA
病毒，病毒颗粒直径
65
‑
90nm
，为无包膜二十面体结构，由
240
个六邻体组成，每个顶点处有
12
个五邻体蛋白，并有从每个五邻体突出的
12
个纤维蛋白三聚体
。
人腺病毒基因组全长约
36kb
，包括早期转录基因
(E1A、E1B、E2、E3、E4)
和晚期转录基因
(L1
‑
L5)。E1Ar/>是基因组中最早被转录的基因，其编码产物与宿主细胞
pRb
蛋白结合，导致
E2F
转录因子与
pRb
蛋白分离，进而激活
E2F
介导其他早期转录基因
(E1B、E2、E3、E4)
的转录，启动病毒
DNA
的复制
。
随后，
E1B
编码的
E1B
‑
55K
蛋白与细胞的
p53
蛋白结合并使之失活，同时
E1B
‑
19K
蛋白作为细胞凋亡因子阻止细胞凋亡
。E2
则编码病毒基因组复制所必需的3种蛋白：前体末端蛋白
(pTP)、
聚合酶
(Pol)
和单链
DNA
结合蛋白
(DBP)。E3
基因编码可破坏宿主免疫反应的蛋白
(10.4K、14.5K、14.7K
和
19K)
，其中
19K
糖蛋白
(gp19)
下调
MHCⅠ介导的抗原呈递给细胞毒性
T
淋巴细胞，从而阻止细胞毒性
T
淋巴细胞对病毒的杀伤作用；在病毒复制晚期，
E3
基因编码的蛋白可促进病毒粒子的释放和加快被感染细胞的死亡
。E4
的基因产物主要参与
DNA
的复制
、
转录
、
宿主细胞蛋白质合成的终止和细胞周期的调节
。
晚期基因的转录起始于主要晚期启动子
(MLP)
，转录产物参与腺病毒基因组的调控，并编码成熟病毒颗粒装配所必需的衣壳结构蛋白
。
[0004]腺病毒能在人体细胞中高效复制，被感染宿主细胞
48h
内能产生约
107拷贝的病毒
DNA
，较高的复制效率使其成为基因治疗载体的主要选择
。
腺病毒感染细胞主要分为3个步骤：
1)
腺病毒的纤维蛋白与宿主细胞膜上的腺病毒
‑
柯萨奇受体
(CAR)
结合；
2)
病毒与整合素受体结合，经过内吞作用进入细胞，脱去衣壳，病毒
DNA
通过核孔进入宿主细胞核；
3)
基因转录及病毒
DNA
复制
。
腺病毒的
DNA
复制主要需要5种蛋白质：包括由病毒自身编码产生的3种蛋白
pTP、Pol
和
DBP
，以及来自宿主细胞的2种细胞转录因子
NFI
和
Oct
‑
1。pTP、Pol
和
DBP
在一起可以启动
DNA
复制，但复制效率低，而且链的延伸有限
。
而细胞转录因子
NFI
和
Oct
‑1的加入使得病毒
DNA
的复制效率增强约
200
倍
。HAdV
的
DNA
复制起始发生于模板链的第4个碱基，形成三核苷酸中间体
pTP
‑
CAT
，然后
pTP
‑
CAT
中间体回跳3个碱基与模板链的残基1‑3配对，在三核苷酸跳跃期间或之后，
Pol
与
pTP
解离，延伸继续
。
[0005]专利
CN202010055543.9
公开了一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，其以野生型人3型腺病毒衣壳蛋白六邻体基因为保护性抗原基因，以
E1、E3
区基因缺失的人5型复制
缺陷型腺病毒为载体，以整合
E1
区基因的
AD293
细胞为包装细胞系，制备得到的疫苗免疫小鼠后，可以诱导机体产生更高的体液免疫
。
专利
CN202110193614.6
则公开了一种人工改造的重组腺病毒载体，其基于黑猩猩型腺病毒
AdC68
基因组序列，完全删除其
E1
序列，改造其
E3
序列和
E4
序列，所述改造包括：
(1)
改造其
E3
序列，保留
orf9
和
orf1
；
(2)
改造其
E4
序列，以
C
亚型人腺病毒基因组
E4
序列中
orf6
和
/
或
orf6/7
替换其
E4
序列中
orf6
和
/
或
orf6/7
；其所述的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且外源基因装载量高
。
[0006]人腺病毒
HAd5C
是目前临床研究中最常用的溶瘤病毒载体，而要实现其溶瘤病毒的安全性及特异性则需要对
HAd5C
基因骨架进行改造，如
fiber
，
hexon
，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种改造人腺病毒
HAd5C
的方法，其特征在于，包括：
(1)
对于敲除腺病毒复制关键基因的
Admax
系统腺病毒骨架载体，构建含抗性筛选标记1的表达框，表达框包含目的基因，同时在抗性筛选标记1两端设置重组酶切位点，得到抗性标记载体1；
(2)
对抗性标记载体1进行抗性筛选，筛选后的载体利用重组酶删除抗性筛选标记；所述的步骤
(1)
中所述的腺病毒复制关键基因为
E3
，目的基因的插入位点在
Δ
E3
处
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤
(1)
中的
Admax
系统腺病毒骨架载体为
pBHGlox(delta)E13Cre
载体
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
中所述抗性筛选标记1的抗性为非氨苄抗性
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组酶包括
Cre
重组酶
、Flpe
重组酶或
Dre
重组酶
。5.
根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的重组酶识别位点为
loxs
位点
、FRT
或
roxP
；所述的
loxs
位点包括
lox2272、loxN
或
lox511。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤
(2)
中所述的利用重组酶删除抗性筛选标记的方法包括体外
Cre
同源重组或大肠杆菌
SW106 Cre
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘奇，王健，田烁，黄文林，
申请(专利权)人：广州达博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：