【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，具体涉及一种nk细胞体外扩增方法。
技术介绍
1、nk细胞是一类天然具有杀伤肿瘤细胞作用的免疫细胞，在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥着关键的作用，能够抵御由病毒感染或者恶性肿瘤引起的异常细胞。nk细胞与t、b淋巴细胞不同，nk细胞无需进行预先致敏就能够有效的识别并杀伤病毒感染的淋巴细胞和肿瘤细胞，使其成为肿瘤细胞免疫治疗的研究热点。然而nk细胞仅占外周血单个核细胞的5-20％，并且nk细胞的活性和数量会受到人体内环境的影响，进而影响其抗肿瘤免疫的作用。由于人体内nk细胞的数量、纯度和活性无法满足其临床应用的需要，阻碍了其大规模的临床应用。
2、目前有两种主流的nk细胞扩增的方案，一种以k562作为滋养细胞的扩增方案。中国专利cn114874986a中公开了一种采用k562细胞扩增nk细胞的方法，包括如下步骤：采用重组慢病毒对k562细胞进行感染，感染时间为10-20h，进行克隆得到工程细胞株；采用钴-60辐照灭菌得到滋养细胞；采用外周血分离单个核细胞，然后加入至nk细胞完全培养基中重悬，加入滋养细胞混合均匀，置于培养箱中培养；培养至第3天时，离心弃掉上清液，加入相同体积的nk细胞完全培养基混合均匀，继续置于培养箱中培养；培养至第7天，补加1-2μg/ml ifn-γ和自体血浆；继续培养至第14天得到采用k562细胞扩增的nk细胞。但k562本身是白细胞瘤细胞，以k562作为滋养细胞的扩增方案存在潜在的致癌风险。
3、另一种nk细胞扩增的方案是以抗体包被结合细胞因子刺激的扩增方案
4、因此，需要提供一种扩增速率较快、nk细胞纯度较高，对肿瘤细胞具有较强的杀伤活性的体外nk细胞的扩增培养方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种nk细胞体外扩增方法，扩增的nk细胞具有较快的增殖速度，具有较高的纯度，对多种肿瘤细胞具有更强的杀伤活性，解决了现有技术中扩增速度慢、纯度低和杀伤活性较差的问题。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供了一种用于nk细胞体外扩增培养的nk细胞培养体系，所述的nk细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的基础培养基选自nk macs培养基、lonza x-vivo15培养基中的一种或多种；所述的补剂由900-1000iu/ml的il-2、0.1-3ng/ml的il-15和4-6％灭活血浆组成。
4、优选地，所述的补剂由950-1000iu/ml的il-2、0.5-2ng/ml的il-15和5％灭活血浆组成。
5、进一步优选地，所述的补剂由1000iu/ml的il-2、1ng/ml的il-15和5％灭活血浆组成。
6、优选地，所述的激活培养基包括nk macs培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/ml的il-12，40-60ng/ml的il-18，40-60ng/ml的il-15，900-1000iu/ml的il-2，4-6％灭活血浆组成。
7、进一步优选地，所述的补剂由8-10ng/ml的il-12，45-55ng/ml的il-18，45-55ng/ml的il-15，950-1000iu/ml的il-2，5％灭活血浆组成。
8、再进一步优选地，所述的补剂由10ng/ml il-12，50ng/ml il-18，50ng/ml il-15，1000iu/ml il-2，5％灭活血浆组成。
9、又一方面，本专利技术提供了一种nk细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：
10、(1)nk细胞体外分离；
11、(2)nk细胞激活培养：加入nk细胞激活培养基，使nk细胞密度为(0.1-5)×106个/ml，转移至培养箱中激活培养24h-48h；
12、(3)nk细胞扩增培养：离心，去除上清，加入扩增培养基重悬细胞，使细胞密度为(0.1-5)×106个/ml，进行培养。
13、优选地，步骤(1)中nk细胞体外分离包括以下步骤：
14、1)将血样离心上层血浆置于新的离心管中灭活，留上清备用；
15、2)在血样中加入pbs稀释血样；
16、3)将稀释后的血样加入到淋巴细胞分离液中；
17、4)离心，中间有一层白色细胞层，吸取白色细胞层置于新的离心管中；
18、5)在离心管中补满pbs，离心，弃上清，得nk细胞。
19、优选地，步骤1)中血样的来源为脐血或外周血。
20、优选地，步骤1)中离心的条件为室温300g离心10分钟。
21、优选地，步骤2)中pbs与血样的体积比为1:1。
22、优选地，步骤3)中血样与淋巴细胞分离液的体积比为1：1。
23、优选地，步骤4)中离心的条件为室温1200g离心10分钟。
24、优选地，步骤5)中离心的条件为室温300g离心10分钟。
25、优选地，步骤(2)中培养箱的温度为37℃。
26、优选地，步骤(2)中培养的时间为48h。
27、优选地，步骤(2)中加入nk细胞激活培养基，使nk细胞密度为1×106个/ml。
28、优选地，步骤(2)中所述的激活培养基包括nk macs培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/ml的il-12，40-60ng/ml的il-18，40-60ng/ml的il-15，900-1000iu/ml的il-2，4-6％灭活血浆组成。
29、进一步优选地，所述的补剂由10ng/ml il-12，50ng/ml il-18，50ng/ml il-15，1000iu/ml il-2，5％灭活血浆组成。
30、优选地，步骤(3)中离心的条件为300-1000g，离心的时间为5-10分钟；
31、进一步优选地，步骤(3)中离心的条件为300g，离心的时间为5分钟。
32、优选地，步骤(3)中去除上清后还包括洗涤细胞步骤，具体为用nk macs培养基洗涤细胞2遍，去净诱导培养基中残留的细胞因子。
33、优选地，步骤(3)中培养的时间为8-10天。
34、优选地，步骤(3)中所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的基础培养基选自nk macs培养基、lonza x本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于NK细胞体外扩增培养的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的NK细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的补剂由900-1000IU/mL的IL-2、0.1-3ng/mL的IL-15和4-6％灭活血浆组成。
2.根据权利要求1所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基选自NKMACS培养基、Lonza X-VIVO15培养基中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基为Lonza X-VIVO15培养基。
4.根据权利要求1所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的补剂由1000IU/mL的IL-2、1ng/mL的IL-15和5％灭活血浆组成。
5.根据权利要求1-4任一项所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的激活培养基包括NK MACS培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/mL的IL-12，40-60ng/mL的IL-18，40-60ng/mL的IL-15，900-1000IU/mL的IL-2，4-6％灭活血浆组成。p>
6.根据权利要求5所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的补剂由10ng/mL IL-12，50ng/mL IL-18，50ng/mL IL-15，1000IU/mL IL-2，5％灭活血浆组成。
7.一种NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的体外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)中激活培养的时间为48h。
9.根据权利要求7所述的体外扩增培养方法，其特征在于，步骤(3)中培养的时间为8-10天。
10.权利要求1-6任一项所述的NK细胞培养体系在扩增NK细胞中的应用。
11.一种NK细胞，其特征在于，所述的NK细胞是通过权利要求7-9任一项所述的体外扩增培养方法制备得到。
...【技术特征摘要】
1.一种用于nk细胞体外扩增培养的nk细胞培养体系，其特征在于，所述的nk细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的补剂由900-1000iu/ml的il-2、0.1-3ng/ml的il-15和4-6％灭活血浆组成。
2.根据权利要求1所述的nk细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基选自nkmacs培养基、lonza x-vivo15培养基中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的nk细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基为lonza x-vivo15培养基。
4.根据权利要求1所述的nk细胞培养体系，其特征在于，所述的补剂由1000iu/ml的il-2、1ng/ml的il-15和5％灭活血浆组成。
5.根据权利要求1-4任一项所述的nk细胞培养体系，其特征在于，所述的激活培养基包括nk macs培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/m...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘奇，钟晨，李文艺，王健，黄文林，
申请(专利权)人：广州达博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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