一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种外泌体冻干粉的制备方法及应用，属于干细胞领域。本发明专利技术的冻干粉包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白，其中，外泌体的制备方法包括以下步骤：(1)细胞复苏；(2)扩增培养；(3)发酵罐培养；(4)收集上清液；(5)外泌体纯化。本发明专利技术的外泌体冻干粉具有更高的活性和稳定性，具有良好的促进损伤修复效果，有利于储存、运输和应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用


[0001]本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、"运载物"和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。
[0003]外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。一类外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称RAB4，RAB5和RAB11主要出现在早期以及回收的核内体中，RAB7和RAB9主要出现在晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白(包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63，CD81和CD9)、热休克蛋白家族(HSP60，HSP70，HSPA5，CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33(结肠上皮细胞来源)、MHC
‑Ⅱr/>(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶(GAPDH，烯醇化酶1，醛缩酶1，PKM2，PGK1，PDIA3，GSTP1，DPP4，AHCY，TPL1，抗氧化蛋白，P4HB，LDH，亲环素A，FASN，MDH1和CNP)、核糖体蛋白(RPS3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子，ARF1，CDC42，人类红细胞膜整合蛋白，SLC9A3R1)、粘附因子(MFGE8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素等。
[0004]多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。但不同种类的细胞产生的外泌体具有不同的功能，如肿瘤细胞分泌的外泌体能够促进肿瘤的生长及转移，干细胞分泌的外泌体能够进行免疫调节，外泌体的功能主要由其母细胞决定。
[0005]干细胞作为万能细胞，其在延缓衰老、调节机体免疫、修复受损组织等方面展现出强大的能力，而这些功能的发挥主要是由干细胞分泌的外泌体(旁分泌)完成的，因此，干细胞外泌体具有巨大的应用空间。
[0006]虽然培养的细胞均能产生外泌体，但通过普通培养细胞的方式产生的外泌体数量有限，且不能使不同批次间的外泌体质量稳定可控，不利于开发为产品。此外，细胞在培养过程中把外泌体分泌到培养基上清液中，但上清液中除了外泌体，还有其他杂质。传统纯化方式是通过梯度离心或者PEG沉淀法来获得较纯的外泌体，但这些方法要么对纯化的体积有要求，要么会引入有害的杂质，均不利于外泌体产品的规模化开发。最后，由于外泌体是
杯状囊泡结构，自身比较脆弱，需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面带来了许多不便。因此，需要研究一种能保证外泌体活性和稳定性的方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用，提高外泌体在储存、运输过程中的活性和稳定性。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术技术方案如下：
[0009]一方面，本专利技术提供一种外泌体冻干粉，包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白。
[0010]优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01
‑
1：0.01
‑
0.1：0.5
‑
5：0.01
‑
0.5：0.01
‑
0.5(mL：g：g：g：g：g)。
[0011]进一步优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.1
‑
0.3：0.03
‑
0.07：1
‑
3：0.05
‑
0.2：0.05
‑
0.2(mL：g：g：g：g：g)。
[0012]最优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(mL：g：g：g：g：g)。
[0013]优选地，所述外泌体为干细胞外泌体。
[0014]进一步优选地，所述外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
[0015]优选地，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
[0016](1)细胞复苏；
[0017](2)扩增培养；
[0018](3)发酵罐培养；
[0019](4)收集上清液；
[0020](5)外泌体纯化。
[0021]进一步优选地，步骤(1)中，所述细胞复苏的条件为37
±
2℃恒温复苏，复苏时间不超过3min。
[0022]进一步优选地，步骤(2)中，所述扩增培养的条件为温度37
±
1℃、CO2浓度5
±
0.5％。
[0023]进一步优选地，步骤(3)中，所述发酵培养的参数为pH：7.20
±
0.05，温度：37℃，DO(溶氧浓度)：40.0
±
20.0％，转速：40
±
2rpm。
[0024]进一步优选地，步骤(5)中，所述纯化为依次进行梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌。
[0025]更进一步优选地，所述梯度过滤纯化用囊式滤器进行，优选为1.5+0.8μm囊式滤器。
[0026]更进一步优选地，所述超滤浓缩使用中空纤维超滤膜进行，更进一步地，所述中空纤维超滤膜为300kD，所述浓缩的倍数为5
‑
20倍，进一步优选为10倍。
[0027]更进一步优选地，所述溶液置换使用PBS(磷酸缓冲盐溶液)进行。所述PBS添加体积为浓缩液的2
‑
8倍，进一步优选为4倍。
[0028]所述溶液置换进行3
‑
5次，进一步优选为4次。
[0029]进一步优选地，所述过滤除菌使用除菌滤器进行，优选为孔径为0.45+0.22μm除菌
滤器。
[0030]作为本申请的一个具体实施方式，所述步骤(5)包括以下步骤：
[0031](1)梯度过滤纯化
[0032]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体冻干粉，其特征在于，包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白。2.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01
‑
1：0.01
‑
0.1：0.5
‑
5：0.01
‑
0.5：0.01
‑
0.5(mL：g：g：g：g：g)。3.根据权利要求2所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.1
‑
0.3：0.03
‑
0.07：1
‑
3：0.05
‑
0.2：0.05
‑
0.2(mL：g：g：g：g：g)。4.根据权利要求3所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(mL：g：g：g：g：g)。5.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。6.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：(1)细胞复苏；(2)扩增培养；(3)发酵罐培养；(4)收集上清液；(5)外泌体纯化。7.根据权利要求6所述的外泌体冻干粉，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞复苏的条件为37
±
2℃恒温复苏，复苏时间不超过3min；步骤(2)中，所述扩增培养的条件为温度37
±
1℃、CO2浓度5
±
0.5％；步骤(3)中，所述发酵培养的参数为pH：7.20
±
0.05，温度：37℃，DO(溶解氧浓度)：40.0
±
20.0％，转速：40
±
2rpm；步骤(5)中，所述纯化为依次进行梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌。8.权利要求1
‑
7任一项所述外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将配方用量的外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白，和水混匀，后经过冷冻干燥制成冻干粉。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序为：序号步骤温度(℃)真空设定值(mbar)时间(分钟)1预冻
‑
40～
‑
50/0.5
‑
1.52保温
‑
40～
‑
50/100
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：翟留涛，陈剑花，彭慧，吴砂，黄曼丽，房芳瑜，黄文林，于中国，
申请(专利权)人：广州达博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：