【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞，特别涉及cd19基因敲除的raji-luc细胞系构建方法及其细胞系。
技术介绍
1、淋巴瘤是最常见的血液肿瘤之一，主要分为非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkinlymphoma,nhl)和霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma,hl)两类。其中，非霍奇金淋巴瘤占所有淋巴瘤的90％，b细胞非霍奇金淋巴瘤的发病率是t细胞淋巴瘤的三倍，在我国常见的恶性肿瘤当中可以排在前10位。
2、cd19是一种表达于除浆细胞以外的所有b细胞系，恶性b细胞与滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells,fdcs)上的表面蛋白，属于免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)超家族的成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)。cd19在b细胞成熟并最终分化为浆细胞的整个过程中都有表达。它是参与b细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，可以促进bcr的信号转导。有研究表明，大多数b细胞恶性肿瘤患者的癌细胞中cd19表达均为正常至高水平。因此，cd19是b细胞恶性肿瘤中最重要的靶抗原之一，是开发嵌合抗原受体car-t细胞对抗非霍奇金淋巴瘤和b细胞白血病的最有希望的靶点。
3、嵌合抗原受体基因修饰t(car-t)细胞疗法是将t细胞进行改造，使其表达一个包括抗原识别域、共刺激域和t细胞激活域的融合蛋白，经过改造的car-t细胞可以特异性识别并消除表达靶抗原的肿瘤细胞，这项免疫疗法被誉为未来肿瘤治疗的希望。目前在car-t相关靶点的研究中，有关cd19的研究也最为完善而成熟。
4、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma,bl)就是一种侵袭性的b细胞淋巴瘤，属于非霍奇金淋巴瘤。1963年，pulvertaft rjv在一位11岁黑种人男孩的左上颌骨的burkitt淋巴瘤中分离得到raji细胞，建立了第一个人类造血系统的连续传代细胞。raji细胞的cd19和cd38呈双阳性表达，常被用做靶细胞进行非霍奇金淋巴瘤的相关研究。本专利技术通过pb转座子系统和crispr cas9技术，构建了raji-luc cd19 ko细胞，为后续探索如何解决car-t细胞疗法由于抗原免疫逃逸而产生的肿瘤复发问题奠定了基础。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种cd19基因敲除的raji-luc细胞系构建方法，所述方法包括以下步骤：
2、步骤1：设计靶向cd19的多个sgrna序列；
3、步骤2：用步骤1的多个sgrna序列构建多个pb-crispr-cd19 sgrna质粒；
4、步骤3：用步骤2的多个pb-crispr-cd19 sgrna质粒分别电转染raji-luc细胞；
5、步骤4：用流式细胞仪检测步骤3得到的电转染后raji-luc细胞的cd19敲除效率和利用细胞培养确定细胞生长状态，筛选出最优的sgrna序列；
6、步骤5：利用最优的sgrna序列构建的pb-crispr-cd19 sgrna质粒批量电转染raji-luc细胞；
7、步骤6：筛选稳定敲除的单克隆raji-luc细胞株。
8、在一种实施方式中，所述最优的sgrna序列是seq idno.1:gctaggtccgaaacattccac。
9、在一种实施方式中，在步骤6中，取电转后的raji-luc cd19细胞，用染色缓冲液重悬细胞，并向其中加入流式抗体避光染色；染色结束后用流式细胞仪检测细胞的转染效率，进行流式分选，将分选后的细胞极限稀释法筛选稳定敲除的单克隆raji-luc细胞株。
10、在一种实施方式中，提供一种利用上述方法构建获得的cd19基因敲除的raji-luc细胞系。
11、在一种实施方式中，提供一种特异性靶向cd19基因的sgrna，所述sgrna的靶向序列为seq id no.1:gctaggtccgaaacattccac。
12、在一种实施方式中，提供一种基于crispr特异性靶向cd19基因的sgrna，所述sgrna的靶向序列为seq id no.1:gctaggtccgaaacattccac。
13、在一种实施方式中，提供上述sgrna在敲除cd19基因或在制备cd19基因敲除细胞系中的应用。
14、在一种实施方式中，提供一种用于敲除sgrna基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的sgrna，或靶向敲除sgrna基因的打靶载体；所述靶向敲除sgrna基因的打靶载体包括上述的sgrna和crispr蛋白基因的编码序列。
15、在一种实施方式中，提供一种基因敲除载体，含有上述的sgrna序列。
16、近年来，抗cd19 car-t细胞在治疗复发或难治性急性b淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤方面取得了快速而持久的显著疗效。然而，在car-t细胞临床治疗的过程中，部分患者出现了最初产生了高应答率，但在后续治疗中治疗失败的现象。2022年，6名患者接受了caribou公司临床研究中第一个具有pd-1敲除的同种异体car-t细胞疗法cb-010的治疗(nct04637763)，其中有3名患者在治疗后6个月内出现复发现象。经研究表明，治疗失败的主要原因是由于肿瘤细胞部分或完全丧失靶抗原表达，即出现了抗原逃逸的现象。这种现象的出现，迫使我们去探究如何使car-t细胞在肿瘤细胞抗原丢失后仍然对其具有杀伤作用或是寻找更加合适的替代靶点。
17、本专利技术通过设计构建pb-crispr-cd19 sgrna质粒，采用电转染的方法构建了cd19敲除的raji-luc细胞。通过流式分选筛选得到稳定敲除的单克隆细胞株。并采用荧光素酶化学发光法验证了raji-luc cd19 ko两组单克隆细胞与raji-luc细胞的荧光素酶表达无显著差异，且不能激活cd19 car-t细胞对其进行杀伤。本专利技术所构建的raji-luc cd19 ko细胞可以模拟肿瘤复发后抗原低表达甚至不表达的情况，荧光素酶基因的表达让后续研究人员可以在体内环境中对肿瘤进行长期观察和检测。对后续改善car-t细胞治疗过程中的抗原逃逸现象以及治疗霍奇金淋巴瘤提供了细胞模型，为进一步提升car-t的治本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CD19基因敲除的Raji-Luc细胞系构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述最优的sgRNA序列是SEQ IDNo.1:GCTAGGTCCGAAACATTCCAC。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤6中，取电转后的Raji-Luc CD19细胞，用染色缓冲液重悬细胞，并向其中加入流式抗体避光染色；染色结束后用流式细胞仪检测细胞的转染效率，进行流式分选，将分选后的细胞极限稀释法筛选稳定敲除的单克隆Raji-Luc细胞株。
4.如权利要求1-3任一所述方法构建获得的CD19基因敲除的Raji-Luc细胞系。
5.一种特异性靶向CD19基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶向序列为SEQ IDNo.1:GCTAGGTCCGAAACATTCCAC。
6.基于CRISPR特异性靶向CD19基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶向序列为SEQID No.1:GCTAGGTCCGAAACATTCCAC。
7.如权利要求5所述的s
8.一种用于敲除sgRNA基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的sgRNA，或靶向敲除sgRNA基因的打靶载体；所述靶向敲除sgRNA基因的打靶载体包括权利要求5所述的sgRNA和CRISPR蛋白基因的编码序列。
9.一种基因敲除载体，含有权利要求5所述的sgRNA序列。
...【技术特征摘要】
1.cd19基因敲除的raji-luc细胞系构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述最优的sgrna序列是seq idno.1:gctaggtccgaaacattccac。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤6中，取电转后的raji-luc cd19细胞，用染色缓冲液重悬细胞，并向其中加入流式抗体避光染色；染色结束后用流式细胞仪检测细胞的转染效率，进行流式分选，将分选后的细胞极限稀释法筛选稳定敲除的单克隆raji-luc细胞株。
4.如权利要求1-3任一所述方法构建获得的cd19基因敲除的raji-luc细胞系。
5.一种特异性靶向cd19基因的sgrna，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建勋，冯娅茹，刘秀盈，宋志茹，刘静静，
申请(专利权)人：深圳细胞谷生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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