【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种经修饰的ctpif1解旋酶，特别是涉及一种能够控制目标多核苷酸穿过生物纳米孔移动的解旋酶，并且特别有助于对多核苷酸进行测序，属于基因工程和遗传工程领域。
技术介绍
1、近些年发展起来的纳米孔测序技术是一种新型的单分子测序技术，其利用电场力驱动单链多核苷酸穿过嵌在绝缘磷脂膜上的纳米级生物孔道蛋白，由于不同的碱基大小，每个核苷酸分子在通过生物纳米孔时会产生特征性的阻碍电流，记录下的这些特征电流信号对应于目标核酸的序列。
2、在“链测序”方法中，单个多核苷酸链通过所述生物纳米孔从而实现核苷酸序列的鉴定。相比于其他测序技术，这种测序技术的优势在于成本低，无需pcr扩增，快速实时便捷，测序读长长(超过150kb)，以及rna及表观遗传修饰直接测序的能力。其被认为是测序领域的革命性技术，具有不可估量的应用价值。
3、但是，纳米孔测序技术也存在严重的限制。在电场作用下，单链多核苷酸穿过纳米孔的速度非常快以至于难以从系统噪音中分辨出单个核苷酸的电流阻碍信号。因此，为了实现对核苷酸的鉴定，链测序使用多核苷酸结合的分子马达来控制多核苷酸穿过所述生物纳米孔的移动。然而，分子马达和多核苷酸的结合并非一成不变，在其控制多核苷酸移动时，尤其是面对很长的核苷酸序列时，分子马达会出现从多核苷酸上发生脱落的问题。此外，在链测序这种单分子水平的测序技术中，分子马达存在许多出乎意料的单分子动态行为，比如某些马达蛋白由于活性差，会出现停滞的现象，从而引起孔道的阻塞，降低了测序的通量。其次，马达蛋白在多核苷酸上的移位会出现向前滑
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术克服了现有技术中多核苷酸穿过纳米孔移位速度过快的问题，提供了一种dna依赖的atpase(ctpif1)解旋酶，其在链测序过程中对于控制多核苷酸穿孔运动是非常有用的，控制多核苷酸穿过纳米孔移位的能力更好，特别有用于多核苷酸测序。
2、ctpif1解旋酶核心共包含五个结构域：1a(reca式(reca-like)马达)域、2a(reca式(reca-like)马达)域、1b(wedge domain)域、2b(sh3式(sh3-like))域和2c域(酵母特有的额外结构)。相应的ctpif1蛋白的结构信息参见accession number：xp_002548760.1。
3、其中，1a和2a域主要参与atp的结合和水解。1b域由一个短的螺旋和一段延伸的环结构构成，被称为“楔形区域”。2b域采取sh-3样的折叠方式，其上的轨道样β发卡结构靠近1b域。此外，2c域为酵母特有的额外结构，对于维持蛋白的整体结构构象具有重要意义。
4、由此，本专利技术在通过修饰连接缩小开口尺寸时，重点放在1b和2b这两个结构域上，倾向于通过共价连接来缩小或者关闭开口。
5、连接方式有两种，一种是通过其自身的天然存在的氨基酸，通过替换插入新的氨基酸，比如半胱氨酸和非天然氨基酸等，来实现连接。另一种是通过连接分子(linkermolecules)，倾向于半胱氨酸之间的连接，连接分子包括：bmoe、bis(peg)2以及bis(peg)3等。
6、本专利技术分别在1b和2b两个结构域上引入半胱氨酸，上述的连接分子通常含有两个功能末端，会与半胱氨酸发生共价连接从而实现1b和2b两部分的连接，使得结合的多核苷酸不会从解旋酶上解离。
7、为此，本专利技术一方面提供了一种修饰的ctpif1解旋酶，其对野生型ctpif1(313-781)氨基酸序列中的四个天然的半胱氨酸进行修饰，本专利技术所有的突变位点都是以野生型ctpif1(313-781)氨基酸序列为基础来说明的，这四个天然的半胱氨酸分别是c61，c142，c168和c222。
8、在本专利技术优选的实施方案中，用丙氨酸(a)，丝氨酸(s)或者亮氨酸(l)取代所述四个天然的半胱氨酸。
9、本专利技术另一方面提供了一种修饰的ctpif1解旋酶，其引入新的用于实现连接的半胱氨酸，其中1b结构域上的引入位点包括r90、n91、k86、k87、s83、s80和q78；2b结构域上的引入位点包括e389、t388、e387、v386、d385、t263、l264、p265、k267和i268。
10、在本专利技术优选的实施方案中，优选的突变组合包括r90c、e387c、c61s、c142s、c168s和c222l。
11、在本专利技术进一步优选的实施方案中，所述的解旋酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12、在本专利技术优选的实施方案中，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
13、本专利技术另一方面提供了一种编码本专利技术的解旋酶的核苷酸序列。
14、在本专利技术优选的实施方案中，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
15、本专利技术另一方面提供了一种本专利技术所述的解旋酶与双马来酰亚胺基乙烷形成的复合体。
16、本专利技术另一方面提供了一种构建体，其包含本专利技术所述的解旋酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
17、在本专利技术优选的实施方案中，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
18、本专利技术另一方面提供了本专利技术所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
19、本专利技术另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体。
20、本专利技术另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，所述装置包含本专利技术所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体。
21、本专利技术另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，包括以下步骤：
22、1、将目标多核苷酸与纳米孔，和本专利技术所述的解旋酶或包含该解旋酶的复合体或包含该解旋酶的构建体接触，使得所述解旋酶、复合体或构建体控制所述目标多核苷酸穿过所述纳米孔；和
23、2、获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述纳米孔相互作用的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸，所述构建体包含解旋酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
24、在本专利技术优选的实施方案中，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
25、在本专利技术优选的实施方案中，所述的一个或多个特征本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰的CtPif1解旋酶，其特征在于，对野生型CtPif1(313-781)氨基酸序列中的四个天然的半胱氨酸进行修饰，所述四个天然的半胱氨酸分别是C61、C142、C168和C222。
2.根据权利要求1所述的解旋酶，其中用丙氨酸(A)，丝氨酸(S)或者亮氨酸(L)取代所述四个天然的半胱氨酸。
3.一种修饰的CtPif1解旋酶，其特征在于，引入新的用于实现连接的半胱氨酸，引入位点包括R90、N91、K86、K87、S83、S80、Q78、E389、T388、E387、V386、D385、T263、L264、P265、K267和I268。
4.根据权利要求3所述的解旋酶，其中突变组合包括R90C、E387C、C61S、C142S、C168S和C222L。
5.根据权利要求4所述的解旋酶，所述的解旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的解旋酶，其特征在于，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
7.编码权利要求1-6中任一项所述的解旋酶的核苷
8.根据权利要求7所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.权利要求1-6中任一项所述的解旋酶与双马来酰亚胺基乙烷形成的复合体。
10.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求1-6中任一项所述的解旋酶或权利要求9所述的复合体和用于结合多核苷酸的结合部分。
11.根据10所述的构建体，其特征在于，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
12.权利要求1-6中任一项所述的解旋酶或权利要求7或8所述的核苷酸序列或权利要求9所述的复合体或权利要求10或11所述的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
13.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中任一项所述的解旋酶或权利要求7或8所述的核苷酸序列或权利要求9所述的复合体或权利要求10或11所述的构建体。
14.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，其特征在于，所述装置包含权利要求1-6中任一项所述的解旋酶或权利要求7或8所述的核苷酸序列或权利要求9所述的复合体或权利要求10或11所述的构建体。
15.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
20.一种包含权利要求7或8所述的核苷酸序列的载体。
21.一种包含权利要求7或8所述的核苷酸序列或包含权利要求20所述的载体的宿主细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种修饰的ctpif1解旋酶，其特征在于，对野生型ctpif1(313-781)氨基酸序列中的四个天然的半胱氨酸进行修饰，所述四个天然的半胱氨酸分别是c61、c142、c168和c222。
2.根据权利要求1所述的解旋酶，其中用丙氨酸(a)，丝氨酸(s)或者亮氨酸(l)取代所述四个天然的半胱氨酸。
3.一种修饰的ctpif1解旋酶，其特征在于，引入新的用于实现连接的半胱氨酸，引入位点包括r90、n91、k86、k87、s83、s80、q78、e389、t388、e387、v386、d385、t263、l264、p265、k267和i268。
4.根据权利要求3所述的解旋酶，其中突变组合包括r90c、e387c、c61s、c142s、c168s和c222l。
5.根据权利要求4所述的解旋酶，所述的解旋酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的解旋酶，其特征在于，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
7.编码权利要求1-6中任一项所述的解旋酶的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.权利要求1-6中任一项所述的解旋酶与双马来酰亚胺基乙烷形成的复合体。
10.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求1-6中任一项所述的解旋酶或权利要求9所述的复合体和用于结合多核苷酸的结合部分。
11.根据10所述的构建体，其特征在于，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷天燕，
申请(专利权)人：北京普译生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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