【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表征目标多核苷酸的方法，特别涉及一种经过改造的突变体cpsc-cpsdk49a蛋白复合物及其应用，属于基因工程和遗传工程领域。
技术介绍
1、作为近年来发展迅猛的第三代测序技术，纳米孔测序依据孔道类型可分为固态孔和生物纳米孔，生物纳米孔即能够允许底物通过的孔道蛋白，以下统称为生物纳米孔。生物纳米孔测序技术的基本原理是在电场力的作用下，带电核酸底物能够通过孔道蛋白，当核酸通过生物纳米孔时，不同碱基及其修饰能够影响通过生物纳米孔的电流强度，产生不同的电流信号，通过对电流信号的解析，可以获得通过纳米孔的核酸的碱基信息。作为影响纳米孔测序技术的关键因素，孔道蛋白的性质至关重要，而孔道蛋白种类单一是目前纳米孔测序技术所面临的主要问题之一，以常用的孔道蛋白——大肠杆菌csgg突变体为例，由于其孔道收缩区厚度能够容纳4-5个碱基，使得单次记录的电流信号是由4-5个碱基的阻碍作用产生，造成后续信号分析难度较大，导致准确率难以达到二代测序的水平。因此，需要发掘具有新型收缩区的孔道蛋白，一方面能够增加纳米孔的可选择种类，另一方面减少电流信号解析难度，进一步提高测序的准确率。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有来源于大肠杆菌的纳米孔蛋白收缩区较厚，导致电流信号检测涉及连续多个核苷酸协同作用的缺点，寻找到一种收缩区厚度较薄的突变体cpsdk49a和cpsc组成的蛋白复合物纳米孔，该蛋白复合物收缩区仅厚度仅从而减少连续多核苷酸的数量，降低电流信号解码难度，提高碱基分辨效率。同时，目前能够
2、第一方面，本专利技术提供一种孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a，其中所述孔蛋白复合物突变体的氨基酸包括seq id no:1和seq id no:2所示的序列或与seq id no:1和seq id no:2具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列。
3、第二方面，本专利技术提供编码上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的核酸序列。
4、在一些实施方案中，所述核酸序列选自：
5、1)如seq id no:3示；
6、2)与seq id no:3所示的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码seq idno:1和2所示氨基酸序列的核酸序列；
7、3)与1)或2)互补的核酸序列。
8、在一些实施方案中，同源性在85％-99％之间。
9、在一些实施方案中，同源性为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
10、第三方面，本专利技术提供包含上述编码基因的重组载体，优选的载体序列为seq idno:4所示的cpsc-cpsdk49a_pet28a。
11、第四方面，本专利技术提供一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有上述重组载体，或者其基因组中整合上述编码基因；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
12、第五方面，本专利技术提供包含上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的产品。
13、在一些实施方案中，所述产品是组合物或试剂盒。
14、第六方面，本专利技术提供上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的制备方法，包括以下步骤：
15、1)构建孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的表达载体；
16、2)孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a表达、纯化。
17、第七方面，本专利技术提供一种膜层，所述膜层中嵌入上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a。
18、在一些实施方案中，所述膜层是磷脂膜层。
19、在一些实施方案中，所述膜层是磷脂单层膜层。
20、第八方面，本专利技术提供一种检测系统，包括上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a或者上述膜层。
21、第九方面，本专利技术提供一种装置，包括上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a、上述膜层或者上述检测系统。
22、第十方面，本专利技术提供上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a、上述膜层或上述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用。
23、在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
24、第十一方面，本专利技术提供上述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a、上述膜层、上述检测系统或上述装置在样品测序和/或检测中的应用。
25、在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
26、有益效果
27、根据已有生物纳米孔测序结果，纳米孔蛋白收缩区(核酸底物电流检测区，也可称为电流信号的读取头)的厚度会决定连续核酸过孔的数量，从而影响电流信号复杂度。本专利技术人通过冷冻电镜技术，解析了高分辨率突变体cpsc-cpsdk49a复合物纳米孔结构结构分析发现cpsc-cpsdk49a纳米孔蛋白收缩区宽度为厚度(附图7)。
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1.一种孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A，其中所述孔蛋白复合物突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列或与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列。
2.编码权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A的核酸序列；
3.包含权利要求2所述核酸序列的重组载体。
4.一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有权利要求3所述的重组载体，或者其基因组中整合权利要求2所述的核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
5.包含权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A的组合物或试剂盒。
6.权利要求1所述孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A的制备方法，包括以下步骤：
7.一种膜层，所述膜层中嵌入权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A；
8.一种检测系统，包括权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体
9.一种装置，包括权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统。
10.权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用；优选地，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
11.权利要求1所述的孔蛋白复合物突变体CpsC-CpsDK49A、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统或权利要求9所述装置在样品测序和/或检测中的应用；优选地，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a，其中所述孔蛋白复合物突变体的氨基酸包括seq id no:1和seq id no:2所示的序列或与seq id no:1和seq id no:2序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列。
2.编码权利要求1所述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的核酸序列；
3.包含权利要求2所述核酸序列的重组载体。
4.一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有权利要求3所述的重组载体，或者其基因组中整合权利要求2所述的核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
5.包含权利要求1所述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的组合物或试剂盒。
6.权利要求1所述孔蛋白复合物突变体cpsc-cpsdk49a的制备方法，包括以下步骤：
7.一种膜...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，
申请(专利权)人：北京普译生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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