【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶催化，具体涉及一种双酶-无机杂化纳米花及其制备方法和用途。
技术介绍
1、酶因其优异的催化活性和反应特异性被广泛应用于医药领域,但酶稳定性差,不可回收而造成的高昂研究成本限制了其发展.为提高其催化活性和稳定性,各种酶固定化技术不断涌现.近年来,杂化纳米花固定化酶技术因在提高酶稳定性和重复利用度的同时,可大大增强酶活,而受到广泛关注。
2、唾液被视为机体应对外来理化以及生物等刺激的首要阵线，且全唾液富含丰富的生物标志物，一些研究表明其具有替代血液用于监测、预后和治疗多种常见疾病的潜能。与血液相比，唾液采集上属于无创非侵入性，患者疼痛不适感相对较少，还可避免经皮损伤和自噬的风险；且唾液收集简便，相对易于储存和运输，其中的化合物保质期相对较长；唾液还可反映个体当前的生理状态，是目前研究较多的无创性诊断材料。
3、唾液淀粉酶（salivary alpha-amylase，saa）是唾液腺合成和分泌唾液蛋白的功能酶，属于口腔中的初级消化酶，可以催化淀粉水解生成麦芽糖，是唾液蛋白的主要成分，占唾液总蛋白40%～50%，常用作反映唾液蛋白分泌的主要指标。而唾液蛋白的分泌是自主神经协调作用的结果，因此唾液淀粉酶被认为是自主神经激活的间接指标。唾液淀粉酶活性是指酶的消化能力，与临床相关性大，被作为一种生物标记物被广泛用于心理压力的研究。唾液淀粉酶除了作为心理疾病的辅助标志物外，如今研究还发现它与其他疾病之间存在关联性，可以作为临床诊断和病情监测的新指标。
4、有研究发现糖尿病会造成相关器官的功能
5、现阶段国内外已有研究团队发现：saa 活性与日本女性的空腹葡萄糖、胰岛素抵抗和血压水平之间存在显著的关联；唾液saa活性在超重/肥胖人群的ngt-igt-t2dm病程演进中具有一定的预测价值，且主要体现在男性超重/肥胖人群；性别因素对t2dm 患者saa活性改变的影响高于降糖治疗；焦虑患者唾液淀粉酶活性与焦虑程度明显正相关；唾液淀粉酶活性水平在反映交感神经兴奋与血压水平、夜间多汗具有一致性，可以用来评估阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的严重程度。
6、因此，作为一种无创评价指标，唾液淀粉酶具有客观的发展前景。而传统实验室检测唾液淀粉酶指标方法，受实验时间及空间影响较大，不具有简便性，且人为操作影响较大，无法有效规避认为误差。为此使用一种新型的检测方法，达到简便、减少误差获得较为准确的实验数据是对唾液研究的必然要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的提供一种双酶-无机杂化纳米花及其制备方法和用途，本专利技术的双酶-无机杂化纳米花将葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶负载于同一载体上，其制作成工作电极应用于化学分析仪上，能够实现对唾液淀粉酶的准确检测，其检测过程具有操作简单、检测快速、宽线性范围、稳定性高等特点。
2、为了解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、所述的双酶-无机杂化纳米花，双酶为葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶，载体为磷酸铜。
4、所述的双酶-无机杂化纳米花，其制备方法包括以下步骤：
5、将葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶溶于磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液ph 7.4，得到混合溶液；向该混合溶液中添加硫酸铜溶液，然后在4℃下孵育12-24小时，然后离心取沉淀，用超纯水洗涤，洗涤后的沉淀物重悬于超纯水中，储存在4℃下备用，得到双酶-无机杂化纳米花混悬液。
6、混合溶液中：磷酸盐缓冲液的浓度为10 mm，葡萄糖苷酶的酶活力为30-80 u/mg，葡萄糖氧化酶的酶活力为80-120 u/mg。
7、硫酸铜溶液的浓度为0.1-0.3m。
8、磷酸盐缓冲液、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、硫酸铜溶液的重量比为800-1200:0.2-0.4:0.08-0.12:1-3。
9、上述方法制备的双酶-无机杂化纳米花，用于电化学法唾液淀粉酶活性检测的用途。
10、优选的，将双酶-无机杂化纳米花制备成工作电极，应用于电化学分析仪上进行唾液淀粉酶活性检测。
11、优选的，所述的工作电极的制备方法包括以下步骤：将双酶-无机杂化纳米花混悬液滴铸在丝网印刷电极的工作电极表面。
12、优选的，所述的工作电极的制备方法包括以下步骤：将初步修饰后的电极，在室温干燥后，在工作电极表面滴加3-10 μl浓度为0.8-1.5mg/ml的双酶-无机杂化纳米花混悬液，置于4℃下过夜干燥，然后滴3-8.μl浓度为0.03-0.08 wt%的nafion，使其表面形成膜，并在4℃下储存，即得。
13、优选的，所述的唾液淀粉酶活性检测包括以下步骤：
14、a、采集唾液样本并过滤后，加入装有淀粉浓度为0.5 wt.%的乙酸盐缓冲液中，乙酸盐缓冲液浓度为0.2 m，ph 6.0；静置反应15分钟后，加入浓度为100 mm的nad+；
15、b、将步骤a制备的溶液滴加在双酶-无机杂化纳米花修饰过的丝网印刷电极表面，反应2 分钟；
16、c、采用电化学分析仪进行检测，对工作电极和对电极之间的电流实时检测，并通过运放转换为电压，经滤波电路和软件算法实现电压信号的滤波去噪；
17、d、将转换后的电压信号进行模数转换成为数字信号，实时绘制电流-时间曲线，并实时显示电流值；
18、e、记录并保存电流曲线，提取100 s处的电流值代入标准曲线，计算得到saa活性水平。
19、本专利技术具有以下优点：
20、本专利技术通过将葡萄糖苷酶和葡萄糖脱氢酶杂化生长而成的载酶纳米花修饰到丝网印刷电极的工作电极表面，对α-唾液淀粉酶与淀粉反应生成的产物麦芽糖进行测定，麦芽糖在电极表面双酶的作用下逐步分解为葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖脱氢酶的作用下分解为葡萄糖内酯，同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh），在特定激励电位下的安培电流值与生成的麦芽糖含量成正比，从而得到安培电流与α-唾液淀粉酶活性的线性关系。基于酶电极响应的分析芯片具有优异的选择性，能够排除唾液中其他共存物质的干扰，并具有较宽的线性范围，适用于健康人群和其他亚健康人群唾液中α-唾液淀粉酶的活性水平测定。
21、本专利技术制备的双酶-无机杂化纳米花制备的工作电极，应用于唾液淀粉酶测定，对于电化学分析仪的精密程度要求不高，能够应用于手持式便携式电化学检测装置上，具有操作简单、装置便携、价格低廉、检测快速、宽线性范围、高稳定性等特点。
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1.一种双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：双酶为葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶，载体为磷酸铜。
2.如权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：
4.如权利要求3所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：硫酸铜溶液的浓度为0.1-0.3M。
5.如权利要求4所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：磷酸盐缓冲液、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、硫酸铜溶液的重量比为800-1200:0.2-0.4:0.08-0.12:1-3。
6.如权利要求1-5任何一项所述的双酶-无机杂化纳米花，用于电化学法唾液淀粉酶活性检测的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：将双酶-无机杂化纳米花制备成工作电极，应用于电化学分析仪上进行唾液淀粉酶活性检测。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的工作电极的制备方法包括以下步骤：将双酶-无机杂化纳米花混悬液滴铸在丝网印刷电极的工作电极表面。
9.如权利要求7所述的用途，其特
10.如权利要求6-9所述的用途，其特征在于，所述的唾液淀粉酶活性检测包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：双酶为葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶，载体为磷酸铜。
2.如权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：
4.如权利要求3所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：硫酸铜溶液的浓度为0.1-0.3m。
5.如权利要求4所述的双酶-无机杂化纳米花，其特征在于：磷酸盐缓冲液、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、硫酸铜溶液的重量比为800-1200:0.2-0.4:0.08-0.12:1-3。
6.如权利要求1-5任何一项所述的双酶-无机杂化纳米花，用于电化学法唾液淀粉酶活性检测的用途。
7.如权利要求6所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：林传权，易长青，刘聪，杨晓，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：
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