表达新城疫病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种表达新城疫病毒

【技术实现步骤摘要】
表达新城疫病毒F基因的重组马立克氏病病毒株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于重组病毒
，具体涉及一种表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]马立克氏病
(Marek
′
s disease
，
MD)
是鸡的一种常见淋巴组织增生疾病，具有高度传染性，通常以在周围神经
、
内脏器官
、
眼睛
、
肌肉和皮肤的形成淋巴样浸润并造成机体免疫抑制为主要特征
。
它是细胞结合型的疱疹病毒，隶属于
α
疱疹病毒科的马立克氏病毒属，具有典型疱疹病毒粒子结构特征，核衣壳为二十面体包裹着基因组
DNA
，在电子显微镜下观察，这些糖蛋白呈尖峰样突起
。
它是唯一可以用疫苗预防的病毒肿瘤性疾病，自
1970
年以来，用于预防疾病症状的有效疫苗已得到广泛使用
。
由于病毒毒力的不断增加，疫苗也在持续更新，最开始使用的疫苗是传代减毒的活疫苗
HPRS
‑
16/Att
，但该疫苗商用价值不高故很快被
HVT
所取代，随着毒力的增强，
HVT
不能抵抗强毒感染时，发现了血清1型的天然弱毒株
CVI988/Rispens
，该疫苗的广泛使用，增强了鸡群对
MDV
强毒株的抵抗力，大大降低了全球各国养禽业的经济损失
。
[0003]新城疫
(Newcastle disease
，
ND)
是由新城疫病毒
(Newcastle disease virus
，
NDV)
强毒株引起的一种禽类烈性传染病
。NDV
隶属于副粘病毒科，副粘病毒亚科，禽副粘病毒属
。NDV
是一种多形性囊膜病毒，直径约为
200
‑
300nm。
根据血凝抑制试验
(HI)
和神经氨酸酶抑制试验
(NI)
的结果，将该属分为9个血清型，但所有的新城疫病毒均属于禽副粘病毒血清1型
。ND
的致死率极高，对全球养殖业经济的影响巨大，可能比任何其他动物病毒对世界经济造成损失都大
。
在家禽产业成熟的发达国家，养殖成本不仅面临来自强毒新城疫暴发的挑战，更重要的是需要包括持续疫苗接种在内的一些控制措施的经济投入
。
此外，即使是在没有
ND
暴发的国家，为了保证其市场交易的安全性，通常也要面临重复检测以保持这种无疾病状态的成本投入
。
目前最好的控制方法仍然是接种疫苗，以达到最大限度的减少经济损失
。
[0004]细菌人工染色体
(Bacterial artificial chromosome
，
BAC)
在
1992
年由
Shizuy
等人构建，是一种以
F
质粒
(F
‑
plasmid)
为基础构建而成的细菌染色体克隆载体
。
典型的
BAC
长度约为
10kb
，包括复制起点
(
例如
oris)、BAC
复制所需的基因
(
例如
repE)、
控制复制速率的基因，即将拷贝数限制为每个细菌内一到两个
BAC(
例如
parA
和
parB)
以及抗生素抗性标记
(
如氯霉素
)。BAC
弥补了传统质粒容量有限的缺点，其最大容量可达
300kb
，且相较于同样能克隆较大的基因组序列的酵母人工染色体
(Yeast artificial chromosomes
，
YAC)
来说更加的稳定，不容易发生非必要的基因组重排和酵母
DNA
污染
。
[0005]为了研究
MDV
各基因的功能，通常将
MDV
基因组分段克隆进一系列的重叠的粘粒
(Cosmid)
或将完整的基因组克隆进
BAC
，以便于直接精准的操纵
MDV
中感兴趣的基因，研究其功能特点
。
将
MDV
克隆进
BAC
中有一下几点优势：一
、
病毒基因组在大肠杆菌中处于稳定状
态并且可以在真核细胞中复制增殖；二
、mini
‑
F
的低拷贝数有利于基因组的遗传稳定性；三
、BAC
克隆适用于大肠杆菌中的重组机制；四
、MDV
为细胞结合性病毒，将其克隆进
BAC
后细菌比细胞更易保存和运输
。
这些显而易见的优点使得
BAC
成为了构建重组疫苗的重要技术手段
。
[0006]近年来马立克氏病
、
非典型性新城疫的不断暴发，说明目前使用的疫苗已无法提供完全保护，因此急需研制出预防和治疗鸡马立克氏病和鸡新城疫的生物制品
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种具有良好的遗传稳定性
、
可以用于制备预防新城疫和鸡马立克氏病的生物制品的表达新城疫病毒
F
基因的重组
CVI988
马立克氏病病毒株及其构建方法和应用
。
[0008]本专利技术提供了如下的技术方案：
[0009]第一方面，提供一种表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株，名称为
rCVI988
‑
F
，保藏编号为：
CGMCC No.45557
，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：
2023
年4月6号，分类命名为：鸡马立克病毒
rCVI988
‑
F。
[0010]进一步的，包括插入马立克氏病病毒
US2
基因第
166769
至
166779
核苷酸位的
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒，所述
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒的核苷酸序列如
SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株，其特征在于，名称为
rCVI988
‑
F
，保藏编号为：
CGMCC No.45557。2.
根据权利要求1所述的表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株，其特征在于，包括插入马立克氏病病毒
US2
基因第
166769
至
166779
核苷酸位的
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒，所述
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述
US2
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
根据权利要求1所述的表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株，其特征在于，所述
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒由新城疫病毒
F
基因
、
卡那霉素
、loxp
位点
、pMLV
启动子序列基因连接而成
。4.
根据权利要求1所述的表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株，其特征在于，所述
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒的结构为
Kan
‑
loxp
‑
CMV
增强子
‑
pMLV
‑
F
‑
sv40PolyA。5.
一种权利要求1～4任一项所述表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株的构建方法，其特征在于，包括：构建带有绿色荧光基因的
CVI988 BAC eGFP
载体；在
CVI988 BAC eGFP
载体中
US2
基因内部插入
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒并替换
US2
基因的第
166769
至
166779
位核苷酸，得到含有
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒的重组质粒；将含有
Kan
‑
loxp
‑
pMLV
‑
F
表达盒的重组质粒转染到
CEF
细胞中，拯救病毒后，利用
cre
‑
loxp
重组系统敲除卡那霉素和
BAC
序列基因，挑斑纯化，得到只表达
NDV
‑
F
基因的重组马立克氏病病毒株
。6.
根据权利要求5所述的表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株的构建方法，其特征在于，所述带有绿色荧光基因的
CVI988 BAC eGFP
载体的构建方法包括：利用引物
gpt eGFP F
和
gpt eGFP R
扩增
eGFP
表达盒；以
CVI988
‑
BAC
为载体，通过
EL250
宿主菌中的
Red/ET
同源重组系统，使带有同源重组臂的
eGFP
表达盒与
gpt
位点的
Kan
‑
SacB
基因发生同源重组，替换
Kan
‑
SacB
；筛选和验证
CVI988
‑
BAC
基因组中可供外源基因插入的位点；经过抗生素筛选和酶切鉴定，得到重组成功的阳性克隆，转染
CEF
细胞后拯救出表达
eGFP
的重组病毒
rCVI988
‑
eGFP。7.
根据权利要求6所述的表达新城疫病毒
F
基因的重组马立克氏病病毒株的构建方法，其特征在于，所述
gpt eGFP F
的序列如
SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，刘华伟，秦爱建，张璐，石彬，邵红霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：