利用制造技术

本发明专利技术公开了利用

【技术实现步骤摘要】
利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及利用
CBE
构建三基因缺失
PRV
毒株的方法和应用
。

技术介绍

[0002]伪狂犬病（
Pseudorabies
，
PR
）是由伪狂犬病毒（
Pseudorabies virus
，
PRV
）感染相关宿主引起的一种烈性传染性疾病
。PRV
无特定的宿主嗜性，可感染包括猪
、
牛
、
羊
、
狗在内的多种哺乳动物
。
猪是其自然宿主和主要传染源，
PRV
可引起仔猪严重的神经症状
。PRV
基因组全长约为
143kb
，
GC
含量高达
70%
，可划分为重复区域
、
独特长区段（
Unique Long
，
UL
）
、
独特短区段（
Unique Short
，
US
）
。UL
区包含胸苷激酶（
thymidine kinase
，
TK
）
、gB
（
glycoprotein B
）
、gC、gH
等基因；
US
区则主要有蛋白激酶（
>protein kinase
，
PK
）
、gD、gE、gI
等基因
。TK、gE
和
gI
三个基因的缺失可降低
PRV
的毒性
。
[0003]早期的基因编辑技术常利用
DNA
同源重组原理，包括
ZFNs
和
TALENs
，但因其设计复杂
、
敲除效率低
、
脱靶严重
、
成本高
、
可操作性差等缺点，发展受到了限制
。CRISPR/Cas9
系统自发现以来由于其高效
、
方便和应用范围广等特点，成为最受欢迎的基因改造工具，实现了基因的成功敲除
。
然而与
ZFNs
和
TALENs
等技术类似，
CRISPR/Cas9
实现基因编辑依赖于
DNA
双链断裂的产生，触发修复，造成非预期的碱基突变或脱靶切割及基因组的结构变异
。
为了克服这一不足，单碱基编辑技术的出现为实现精确高效的碱基转换带来了希望
。
[0004]单碱基编辑技术是利用无核酸酶切割活性或切割单链产生缺口活性的改造型
Cas
蛋白和脱氨酶进行融合，依靠
sgRNA
准确地将脱氨酶锚定到靶位点，进行碱基脱氨，从而实现单碱基的精确编辑，极大提高了碱基编辑的精确度和效率
。2016
年，刘如谦教授团队研发出了碱基编辑器（
Base Editor, BE
），可直接
、
不可逆转地将
DNA
链上的碱基
C
替换为
T
（或者将
G
替换为
A
），无需切割
DNA
双链或提供同源
DNA
模板
。
研究人员将无切割
DNA
双链活性的
dCas9
通过
linker
序列与大鼠胞嘧啶核苷脱氨酶
(rAPOBEC1)
相融合，构建出第一代碱基编辑器
BE1
；后引入了尿嘧啶
DNA
糖基酶抑制剂（
uracil DNA glycosylase inhibitor
，
UGI
），构建出第二代碱基编辑器
BE2
；为利用细胞中的错配修复机制促进非编辑链以编辑链为模板进行修复，进一步增强点突变效率，研究人员恢复了
dCas9
的
DNA
单链切割活性（
Cas9n D10A
），构建出第三代碱基编辑器
BE3。BE3
是目前运用较为广泛的经典胞嘧啶碱基编辑器
(cytosine base editor, CBE)。
随着
CBE
编辑系统的不断优化和发展，研究人员又先后开发出
BE4、SaBE4、BE4
‑
Gam、SaBE4
‑
Gam、BE4max
和
Anc BE4max
，进一步提高了碱基编辑的效率
。CBE
系统凭借其高效精确的基因编辑效果，为相关疾病的基因治疗
、
动物疾病建模
、
微生物研究等提供了强有力的技术手段
。
目前
CBE
在
PRV
基因组改造中已经开始尝试，但只是涉及单个基因单一位点的简单突变，未进行一步法进行多个基因的多个位点同时编辑类似复杂突变，本专利技术通过优化
CBE
载体选择和
sgRNA
设计，一步实现了
TK、gE
和
gI
三个基因的六个位点均突变成功，蚀斑纯化后成功获得了三基因缺失的
PRV
‑
Δ
TK/
Δ
gI/
Δ
gE
‑
CBE
毒株
。
[0005]现有的
ZFNs、TALENs
耗时耗力使用昂贵，
CRISPR/Cas9
效率低，筛选困难，同时因为
基因组的断裂造成结构变异的产生，新型的碱基编辑工具
CBE
通过引入终止密码子诱导基因表达的提前终止，可以实现沉默的目的，但产生的旁观者效应较多，同时受
PAM
限制，有些区域无法编辑
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供利用胞嘧啶碱基编辑器快速构建
gE、gI、TK
基因缺失
PRV
毒株的方法和应用
。
[0007]本专利技术的技术问题解决方案如下：
gE、gI、TK
基因缺失的
PRV
毒株，于
2023
年6月
30
日保藏在中国典型培养物保藏中心（
CCTCC
），保藏编号
CCTCC NO
：
V202375
，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，命本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. gE、gI、TK
基因缺失的
PRV
毒株，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号
CCTCC NO
：
V202375
，所述
gE、gI、TK
基因缺失的
PRV
毒株利用胞嘧啶碱基编辑器构建得到
。2.
根据权利要求1所述的
gE、gI、TK
基因缺失的
PRV
毒株，其特征在于，其编码
gE
基因序列如
SEQ ID NO.14
所示，其编码
gI
基因序列如
SEQ ID NO.15
所示，其编码
TK
基因序列如
SEQ ID NO.13
所示
。3.
利用
CBE
构建
gE、gI、TK
基因缺失
PRV
毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1
：构建
sgRNA
骨架质粒；选择
PRV
病毒中
gE、TK、gI
三基因作为靶标位点，利用胞嘧啶碱基编辑器设计
sgRNA
序列，根据
sgRNA
上下游序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链
DNA
片段，将
pU6
‑
sgRNA
‑
Puro
‑
2A
‑
EGFP
载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与上述带粘性末端的双链
DNA 片段连接，获得连接产物，即
sgRNA
表达载体；所述胞嘧啶碱基编辑器为
pCMV
‑
hA3A
‑
BE3
‑
Y130F
；将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；
S2
：质粒转染；将质粒转染至
Vero81
细胞中，对通过转染获得的病毒进行蚀斑纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶昱，顾俊，曾川，沈金燕，王培霞，唐玉新，王妮，白雨溦，黄冬艳，宋德平，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：