用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌制造技术

本发明专利技术涉及携带失活的wadC基因和失活的ppdK基因的属于布鲁氏菌属的改性细菌及其用途。本发明专利技术还涉及针对人和/或动物的布鲁氏菌病的疫苗，其包含携带失活的wadC基因和失活的ppdK基因的属于布鲁氏菌属的改性细菌。

【技术实现步骤摘要】
用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌本申请是申请日为2015年7月7日、申请号为“201580037525.5”、专利技术名称为“用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及用作针对布鲁氏菌病的疫苗的布鲁氏菌(Brucela)属的改性细菌。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的细菌性人畜共患病，布鲁氏菌是在反刍动物、猪(suid)、犬科动物、骆驼科动物和数种野生动物中表现为兼性细胞内寄生菌的革兰氏阴性菌属。这些细菌极度具有传染性，且人容易从动物及其产品中感染布鲁氏菌病。存在几种高度同源的布鲁氏菌种(Moreno等,Vet.Microbiol.90,209-227,2002；Chainetal.,Infect.Immun.73,8353-8361,2005)，其中牛布鲁氏菌(B.abortus)优选感染牛，羊布鲁氏菌(B.melitensis)优选感染绵羊和山羊，猪布鲁氏菌(B.suis)优选感染猪和野生动物。这三个种是人布鲁氏菌病的主要原因。绵羊也可以被绵羊附睾布鲁氏菌(B.ovis)感染。布鲁氏菌病是动物中流产和不育的主要原因，因此造成重大经济损失。在牛中，通常估计产量(肉、牛奶、扑杀成本)降低50％。全世界易感布鲁氏菌病的家畜数量估计为约4.000.000.000，其中该数量的少于20％在没有疾病的国家(匿名来源，2006)。全世界范围内，在欧盟边境南部和东部的国家(Seimenis等,Ann.Ist.Super.Sanita.42,437-445,2006)和在低收入国家，布鲁氏菌的发病率非常高。在USA、欧盟地区北部和法国，在大量投资和多年的疫苗接种和扑杀后，已经成功消除牛病(bovinedisease)。已经证明羊布鲁氏菌感染更加棘手，主要是由于在半干旱地区的粗放型养殖条件下，动物管理困难。人布鲁氏菌病总是动物布鲁氏菌病的后果，且最常由羊布鲁氏菌引起。如果不治疗，人布鲁氏菌病导致严重的无效后果，且在约3％的病例中是致命的。由于在疾病流行的大多数国家的医疗服务不足，关于人类该疾病的全球发病率尚无可靠的数据。发病率数据变化非常大(从<0.01至>200每100,000)，反应了在虽然严重但缺乏特征性症状因而报道较少的疾病的认识上的困难(Corbel,Emerg.Infect.Dis.3,213-221,1997)。通常估计数据为500.000新病例/年(Pappasetal.,LancetInfect.Dis.6,91-99,2006)，来自其中实施诊断的近东和亚洲新兴经济体的最新数据证实该疾病在人类中的发病率非常高(例如，伊朗为15.000新病例/年，或中国北部的发病率为几乎1400病例/100000人)(匿名,IranianJournalofMicrobiology,5:183.1,2013)。因为所有这些情况，世界卫生组织已经将布鲁氏菌病分类为七大“被忽视的细菌性人畜共患病”，所述疾病是同时威胁人类健康并造成贫困持续的一类疾病。疫苗接种对控制并消除反刍动物的布鲁氏菌病至关重要(Nicoletti,CRCPress,BocaRaton.,283-299,1990；Garin-Bastujietal.,Vet.Res.29,255-274,1998)。因为没有人疫苗，这也是减少人感染的最佳方法。疫苗牛布鲁氏菌S19和羊布鲁氏菌Rev1对牛中的牛牛布鲁氏菌和山羊和绵羊中的羊布鲁氏菌有效。然而，这些传统的疫苗不提供100％的保护，对人是剧毒的，且在Rev1的情况下，对链霉素(治疗布鲁氏菌病选择的抗生素之一)耐药(Garin-Bastuji等,Vet.Res.29,255-274,1998；Arizaetal.,PLoS.Med.4,e317,2007)。此外，它们在怀孕动物中是堕胎药。这个最后的缺点对疫苗Rev1而言是非常明显的，且严重妨碍对世界上大多数地区的小型反刍动物的布鲁氏菌病控制而言所必需的大规模疫苗接种策略的应用((Blasco和Molina-Flores,Vet.Clin.NorthAm.FoodAnimPract.27:95–104,2011)。因此，需要开发更安全的且更有效的针对布鲁氏菌病的疫苗。在感染发作时，布鲁氏菌具有避免天然免疫检测的能力，从而延缓适应性细胞反应并使致病菌能够到达受保护的细胞内环境。该能力与天然免疫病原体识别受体(PRR)不能鉴别布鲁氏菌表面分子有关，所述表面分子通常携带同源的病原体相关分子模式(PAMP)(Barquero-CalvoE等,PLoSONE2:e631,2007)，尤其是这些菌株的脂多糖(LPS)。因此，这些布鲁氏菌分子是开发更有效疫苗的靶标。LPS，革兰氏阴性菌表面最明显的携带PAMP的分子之一，是由三个连续片段组成的糖脂：脂质A、核心寡糖和多糖O侧链(O-PS)。对比研究已经建立了布鲁氏菌脂质A在毒力中的明确作用(Lapaque等,2005)。类似地，布鲁氏菌LPSO-PS在毒力中至关重要，但它的移除产生过度衰减和不良疫苗(布鲁氏菌的R形式)(González等,2008；Barrio等,2009)。WO2011/033129公开了基于改性布鲁氏菌的针对布鲁氏菌病的新疫苗，所述改性布鲁氏菌携带编码参与合成LPS核心的糖基转移酶的失活基因(wadC)。破坏wadC移除部分核心但不影响O-PS。已经发表了对牛布鲁氏菌的wadC突变体(BABΔwadC)的生物学性质分析(该菌株之前被Conde-Alvarez等,PLoSPathog.,8(5),e1002675,2012描述为BaΔwadC)。BABΔwadC不能在骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中繁殖，并在这些细胞中引发强烈的IL-12反应，这引起保护性的Th1反应。BABΔwadC提供的针对牛布鲁氏菌的保护与用S19疫苗获得的类似(Conde-álvarez等,PLoSPathog.,8(5),e1002675,2012)。因此，针对布鲁氏菌的BABΔwadC疫苗与S19同样有效，但携带比S19所描述的更少的突变。因此，BABΔwadC突变体代表在针对布鲁氏菌病的疫苗领域的极大进步，但仍然需要开发针对该疾病的具有更高功效的新的更安全的疫苗。专利技术简述专利技术人已经阐述了包含于糖酵解/糖异生和Krebs循环通路的布鲁氏菌的一组代谢突变体，并用这些突变体之一作为针对布鲁氏菌病的疫苗。本专利技术的布鲁氏菌属的突变细菌携带编码参与合成LPS核心的糖基转移酶的失活基因(BABΔwadC)和编码参与若干代谢通路(例如Kreb循环和糖异生)的酶(丙酮酸磷酸二激酶(ppdK:ORFBAB1_0525；或同源物))的失活基因。因此，本专利技术涉及突变体BABΔwadCΔppdK。专利技术人发现，这种BABΔwadCΔppdK突变体显示正常的胞内运输，但它一旦到达复制环境，则显示细胞内增殖缺陷。基因ppdK和wadC的突变组合在布鲁氏菌病小鼠模型中产生针对布鲁氏菌病的高度有效的疫苗。因此，本专利技术涉及属于布鲁氏菌属的改性细菌，其携带包含以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种布鲁氏菌属的改性细菌，其中所述细菌的wadC基因和ppdK基因均失活。/n

【技术特征摘要】
20140710 EP 14306125.7;20150417 EP 15305578.51.一种布鲁氏菌属的改性细菌，其中所述细菌的wadC基因和ppdK基因均失活。


2.根据权利要求1所述的改性细菌，其中所述细菌进一步表达将脂多糖(LPS)的多糖O侧链酰化的异源酶。


3.根据权利要求2所述的改性细菌，其中所述异源酶将多糖O侧链的骨胺酰化。


4.根据权利要求2或3所述的改性细菌，其中所述异源酶将乙酰基转移至多糖O侧链。


5.根据权利要求2-4任一项所述的改性细菌，其中所述异源酶是由大肠杆菌的wbdR基因表达的N-乙酰转移酶。


6.根据权利要求1-5任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：JP·戈维尔，V·阿塞戈韦尔，S·阿尼菲，R·康德阿尔瓦瑞兹，I·莫里昂，M·伊里亚特，A·祖尼加里帕，
申请(专利权)人：国家医疗保健研究所，国家科学研究中心，埃克斯马赛大学，纳瓦拉大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR