增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌中，利用人工强启动子kasOp*过量表达内源Subtilisin编码基因，促进了谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，使谷氨酰胺转氨酶的发酵产量得以提高。本发明专利技术通过增强Subtilisin编码基因的转录水平，促进了谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平，最终谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株提高22％。通过本发明专利技术可显著提高谷氨酰胺转氨酶的发酵产量，同时使发酵成大幅降低。

【技术实现步骤摘要】
增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种提高Subtilisin编码基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。
技术介绍
谷氨酰胺转氨酶(TGase)是由茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TGase作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TGase制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等。目前该酶产量仍然较低，有待进一步提升。本专利技术发现，Subtilisin蛋白参与TGase酶原的活化成熟，是一个与TGase产量提高有重要关系的蛋白。进一步的，本专利技术通过基因组学信息找到了Subtilisin编码基因SMDS_5092。增强Subtilisin编码基因的表达可以促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种增强Subtilisin基因转录水平以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种提高Subtilisin编码基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法；通过在茂源链霉菌IPIO中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：第一方面，本专利技术涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的菌株，所述菌株的Subtilisin编码基因过量表达。作为本专利技术的一个实施方案，所述菌株为茂源链霉菌。作为本专利技术的一个实施方案，所述菌株过量表达内源的Subtilisin编码基因。作为本专利技术的一个实施方案，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092。其序列如SEQIDNO.1所示。获得的突变株基于过量表达内源Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进TGase酶原的活化成熟，最终提升TGase的产量。第二方面，本专利技术涉及一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体，所述载体包含源于茂源链霉菌的Subtilisin编码基因。作为本专利技术的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因源于茂源链霉菌IPIO。作为本专利技术的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQIDNO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。作为本专利技术的一个实施方案，所述过量表达为同源过量表达。第三方面，本专利技术涉及一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体的构建方法，通过PCR扩增得到Subtilisin编码基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。作为本专利技术的一个实施方案，通过PCR扩增得到1527bp的SMDS_5092基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*中人工强启动子kasOp*下游的NdeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ1754。作为本专利技术的一个实施方案，所述扩增采用的引物为序列如SEQIDNO.2/3所示的引物SMDS_5092-F/R。第四方面，本专利技术涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，将前述的整合型质粒载体，或前述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌茂源链霉菌中进行重组获得所述菌株。作为本专利技术的一个实施方案，所述重组为位点特异性重组。作为本专利技术的一个实施方案，重组之后还包括通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株的步骤。第五方面，本专利技术涉及一种提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强Subtilisin编码基因的转录水平以提高茂源链霉菌发酵生产氨酰胺转氨酶的产量。作为本专利技术的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因源于茂源链霉菌IPIO。作为本专利技术的一个实施方案，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQIDNO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。作为本专利技术的一个实施方案，在茂源链霉菌过量表达内源的Subtilisin编码基因获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。作为一个具体示例，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092，获得过量表达突变株，发酵，获得谷氨酰胺转氨酶。通过在茂源链霉菌IPIO中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的Subtilisin编码基因SMDS_5092，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的活化成熟，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量。作为本专利技术的一个实施方案，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200-220rpm的条件下发酵26-28h。还可包括收集发酵液并进行酶活检测的步骤。作为一个具体示例，所述发酵包括以下步骤：将活化后的过表达突变株孢子接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200rpm的条件下发酵26h。作为本专利技术的一个实施方案，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O0.1-0.3w/v％。作为一个具体示例，所述种子培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·7H2O0.2w/v％，K2HPO4·3H2O0.2w/v％。作为本专利技术的一个实施方案，所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨1-3w/v％，MgSO4·7H2O0.1-0.3w/v％，K2HPO4·3H2O0.1-0.3w/v％，发酵促进剂0.1-0.4w/v％。作为一个具体示例，所述发酵培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·7H2O0.2w/v％，K2HPO4·3H2O0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％。本专利技术所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《XinjuanNing,XinranWang,YuantingWu,QianjinKang*andLi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述菌株的Subtilisin编码基因过量表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述菌株的Subtilisin编码基因过量表达。


2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的Subtilisin编码基因SMDS_5092。


3.一种用于过量表达Subtilisin编码基因的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体包含源于茂源链霉菌的Subtilisin编码基因。


4.根据权利要求3所述的整合型质粒载体，其特征在于，所述Subtilisin编码基因为序列如SEQIDNO.1所示的Subtilisin编码基因SMDS_5092。


5.一种根据权利要求3或4所述的整合型质粒载体的构建方法，其特征在于，通过PCR扩增得到Subtilisin编码基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。


6.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，将如权利要求3或4所述的整合型质粒载体，或如权利要求5所述的方法构建得到的整合型质粒载体接合转移导入受体菌茂源链霉菌中进行重组获得所述菌株。


7.一种提高谷氨酰胺转...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，王丹，张晓健，
申请(专利权)人：上海交通大学，上海东之汇生物科技有限公司，泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31