一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用技术

一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。针对嘌呤从头合成途径中，嘌呤操纵子pur的转录抑制以及嘌呤化合物难以积累的问题，本发明专利技术提供了一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA(Genbank登录号为948874)构建获得的，本发明专利技术还利用上述突变体作为出发菌株，过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF，构建获得高产次黄嘌呤的重组菌。本发明专利技术首次实现了调控因子arcA在嘌呤操纵子pur基因表达的调控和在嘌呤生物合成中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
嘌呤类化合物是细胞内重要生命活性物质，在细胞内遗传物质的合成与传递、信号转导、能量供应等均具有重要作用。另外，嘌呤类化合物作为前体可以合成多种药物，在疾病的诊断和治疗以及生命科学研究等领域也有广泛的应用。例如早期的巯基嘌呤类药物，以及后期的氟达拉滨、克罗拉滨等嘌呤类核苷药物在癌症治疗方面发挥重要作用。嘌呤的从头合成路线早已探明，嘌呤的从头合成主要以谷氨酰胺和5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)为前体，经过10步反应合成第一个带有嘌呤环的化合物次黄嘌呤核苷酸(IMP)，IMP进一步转化为不同的嘌呤化合物及嘌呤类核苷酸。大肠杆菌中IMP生物合成的相关基因大部分以嘌呤操纵子pur形式存在。嘌呤的从头合成受到转录阻遏调控、关键酶的反馈抑制调控等多层次、不同水平的严密调控，导致细胞内嘌呤的积累非常低。其中嘌呤操纵子pur的转录抑制是限制嘌呤合成基因表达和嘌呤化合物积累的重要因素。因此提高嘌呤pur操纵子的基因表达水平是提高嘌呤类化合物及其衍生物生物合成的重要途径。DNA结合转录二组分调控因子ArcA在嘌呤操纵子pur基因表达的调控作用和在嘌呤生物合成中的应用暂无报道。
技术实现思路
针对嘌呤从头合成途径中，嘌呤操纵子pur的转录抑制以及嘌呤化合物难以积累的问题，本专利技术将全局调控因子ArcA首次应用于嘌呤操纵子pur的调控，提高嘌呤操纵子pur的基因表达水平和嘌呤化合物的生物合成，技术方案如下：首先本专利技术提供了一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA构建获得的，所述DNA结合转录二组分调控因子arcA，Genbank登录号为948874。本专利技术还提供了上述突变体的构建方法，利用P1噬菌体转导法在大肠杆菌基因组中敲除DNA结合转录二组分调控因子arcA，构建获得突变菌株E.coli△arcA。优选地，所述大肠杆菌为E.coliW3110。本专利技术还提供了一种高产次黄嘌呤的重组菌，所述重组菌过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF，出发菌株为上述的敲除了大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA的大肠杆菌突变体。进一步地限定，所述突变的PRPP合成酶基因prs，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述突变的PRPP转酰胺酶基因purF如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了上述高产次黄嘌呤的重组菌的构建方法，步骤如下：1)突变的PRPP转酰胺酶基因purF的制备：以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.6克隆获得K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.7克隆获得K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQIDNO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.8克隆获得P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.9克隆获得P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQIDNO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；所述K326Q是指PRPP转酰胺酶基因purF编码的第326位赖氨酸突变为谷氨酰胺，所述P410W是指PRPP转酰胺酶基因purF编码的第410位脯氨酸突变为色氨酸；2)将步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF连接到中间载体上，获得重组质粒I；3)突变的PRPP合成酶基因prs的构建：以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.11克隆获得D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQIDNO.12和SEQIDNO.13克隆获得D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQIDNO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；所述D128A是指PRPP合成酶基因prs编码的第128位的天冬氨酸突变为丙氨酸；4)将步骤3)所得的D128A突变的PRPP合成酶基因prs连接到步骤2)所得的重组质粒I中，获得过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF的重组质粒II；5)将步骤4)所得的重组质粒II导入前述的突变体中，获得高产次黄嘌呤的重组菌。进一步地限定，步骤2)所述中间载体为pACYCDuet-1。进一步地限定，步骤5)所述重组质粒II导入突变体的方法为热激转化法。本专利技术还提供了上述重组菌在合成次黄嘌呤或次黄嘌呤衍生物中的应用。进一步地限定，所述次黄嘌呤或次黄嘌呤衍生物的合成方法如下：在发酵培养基中，接种上述的高产次黄嘌呤的重组菌，以葡萄糖为碳源，37℃，180rpm的条件下发酵48h。本专利技术中PRPP合成酶基因prs来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，在GenBank上记载的全名为ribose-phosphatediphosphokinase，为磷酸核糖二磷酸激酶，GeneID为945772。D128A突变的PRPP合成酶基因prs即PRPP合成酶基因prs中含有D128A突变，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。D128A即表示第128位的氨基酸D突变为A。本专利技术中PRPP转酰胺酶基因purF来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，在GenBank上记载的全名为amidophosphoribosyltransferase，为磷酸核糖氨基转移酶，GeneID为946794。K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF即PRPP转酰胺酶基因purF中含有K326Q、P410W双突变，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。K326Q、P410W双突变即表示第326位的氨基酸K突变为Q，且第410位的氨基酸P突变为W。本专利技术所述的P1噬菌体转导法是本领域基因敲除的常用技术之一，按照标准的操作方法操作即可。本专利技术中所涉及的定义和缩写对照如下：DNA结合转录二组分调控因子：arcA磷酸核糖焦磷酸：PRP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，其特征在于，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA构建获得的，所述DNA结合转录二组分调控因子arcA，Genbank登录号为948874。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，其特征在于，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA构建获得的，所述DNA结合转录二组分调控因子arcA，Genbank登录号为948874。


2.权利要求1所述的突变体的构建方法，其特征在于，利用P1噬菌体转导法在大肠杆菌基因组中敲除DNA结合转录二组分调控因子arcA，构建获得突变菌株E.coli△arcA。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliW3110。


4.一种高产次黄嘌呤的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF，出发菌株为权利要求1所述的突变体。


5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述突变的PRPP合成酶基因prs，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述突变的PRPP转酰胺酶基因purF如SEQIDNO.2所示。


6.权利要求4或5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)突变的PRPP转酰胺酶基因purF的制备：
以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.6克隆获得K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.7克隆获得K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQIDNO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；
以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.8克隆获得P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.9克隆获得P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，利用片段搭桥法搭桥P...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广，刘敏，咸漠，富盈昕，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37