用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统技术方案

本发明专利技术提供一种能改善外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌生产的融合表达系统，所示融合表达系统包含一种与外源蛋白融合的天然糖苷水解酶。本发明专利技术还提供利用所述融合表达系统生产外源蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统
本专利技术属于生物技术和基因工程
，具体地涉及一种基于糖苷水解酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)融合表达系统。本专利技术还涉及利用所述融合表达系统在枯草芽孢杆菌中分泌生产外源蛋白的方法。专利技术背景蛋白质的重组生产是现代生物技术和酶工业应用中的重要技术之一。与胞内生产相比，由于分泌过程有利于蛋白质在低还原环境下折叠、可溶性表达及生物活性保持，同时分泌蛋白易于纯化，简化了下游操作步骤，所以分泌表达是一种理想的外源蛋白生产方式。枯草芽孢杆菌是一般认为安全(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)的食品级微生物，具有较好的分泌能力、易于培养、不产生内毒素、遗传操作相对简单和发酵工艺成熟等优点，被认为是理想的外源蛋白表达宿主菌。目前为止许多来源于不同生物的外源蛋白已经在B.subtilis中实现了分泌表达，但分泌量低这一瓶颈仍未得到解决。其中，外源大蛋白，例如分子量大于80kDa的大蛋白的分泌尤为困难。目前，除芽孢杆菌属的两个普鲁兰酶以较高水平分泌外，仅极少数80kDa以上的外源蛋白在枯草芽孢杆菌中成功分泌，且分泌量非常低，仅有几十毫克每升。因此，亟需有效改善外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌生产的方法。
技术实现思路
本专利技术人发现将编码来源于枯草芽孢杆菌的糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶(B.subtilisnativeglycosidehydrolasefamily5endoglucanase，BsCel5)的DNA片段与编码目的蛋白的第二个DNA片段融合在一个读码框中时，所编码的融合蛋白的分泌水平明显提高。本专利技术人还发现，BsCel5能够有效改善外源大蛋白，例如分子量大于80kDa的外源蛋白的分泌。因此，本专利技术的第一个方面提供基于糖苷水解酶的融合表达系统。所述融合表达系统包含能够编码至少以下元件的DNA序列，所述元件包括信号肽、糖苷水解酶和外源蛋白，并且依上述顺序排列融合在一个开放读码框内。所述糖苷水解酶包含如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列包含纤维素结合模块(CBM)，其能够有效结合纤维素，从而便于融合蛋白的回收。优选地，所述糖苷水解酶为枯草芽孢杆菌天然糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶BsCel5，其序列如SEQIDNO.2所示。编码BsCel5的DNA序列在SEQIDNO.1中示出。任选地，糖苷水解酶和外源蛋白之间可插入接头序列、用于蛋白酶剪切的靶位点或内含肽。任选地，信号肽和糖苷水解酶之间可插入前肽序列以提高融合蛋白的分泌水平。本领域技术人员可以理解，本领域已知的可在枯草芽孢杆菌中起作用的各种信号肽均可用于本专利技术，包括但不限于，来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽、来源于枯草芽孢杆菌的α淀粉酶amyE信号肽和来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的amyL信号肽。优选地，本专利技术中使用的信号肽为来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽。本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种枯草芽孢杆菌菌株均可用作本专利技术的融合表达系统中的宿主。优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为敲除蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于WB800、WB600、SCK6、1A751。更优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为敲除蛋白酶和α淀粉酶的菌株。可将糖苷水解酶蛋白序列最小化至某种程度而仍维持其在融合蛋白表达中使用时的有利特性。这种对DNA序列以及因此所编码的蛋白质序列的最小化可通过分子生物学领域已知的任何方法实现。本专利技术的第二个方面提供利用所述融合表达系统在枯草芽孢杆菌中分泌生产外源蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：(1)构建合适的枯草芽孢杆菌细胞，其包含能够编码至少以下元件的DNA序列，所述元件包括信号肽、糖苷水解酶和外源蛋白，并且依上述顺序排列融合在一个开放读码框内；(2)在适于生长和分泌的条件下培养步骤(1)中所构建的细胞；和(3)回收所述蛋白。其中，信号肽和糖苷水解酶如上文对于融合表达系统所描述的。优选地，步骤(3)包括使用固体纤维素例如再生无定形纤维素(Regeneratedamorphouscellulose，RAC)回收所述蛋白。任选地，糖苷水解酶和外源蛋白之间可插入用于蛋白酶剪切的靶位点，并且所述分泌生产外源蛋白的方法包括在所述靶位点切割融合蛋白。任选地，糖苷水解酶和外源蛋白之间可插入内含肽序列，并且所述分泌生产外源蛋白的方法包括在合适的条件下断裂内含肽。本专利技术的有益效果为：(1)通过利用本专利技术的融合表达系统或方法，有可能以较高产量产生所需外源蛋白，尤其是分子量大于80kDa的外源蛋白，从而使生产更经济；(2)本专利技术的融合表达系统或方法中使用的糖苷水解酶包含纤维素结合模块，使得融合蛋白能够特异性结合固体纤维素，因此融合蛋白的回收可通过简单的固体/液体分离进行，有利于降低生产成本。附图说明图1A和B分别为重组质粒pNWP43N-StIA和pNWP43N-BsCel5-StIA的图谱。其中P43、RBS、SPnprB、Bscel5、StIA和term分别代表P43启动子、核糖体结合位点、来源于枯草芽孢杆菌168的蛋白酶NprB的信号肽编码序列、BsCel5基因、来源于硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)的异淀粉酶基因和BsCel5的终止子。箭头显示这些基因的转录方向。图2为两种表达方式下StIA分泌的SDS-PAGE比较。泳道1，蛋白marker；泳道2，阴性对照(pNWP43N)表达上清；泳道3，包含pNWP43N-StIA的枯草芽孢杆菌菌株的培养上清；泳道4，包含pNWP43N-BsCel5-StIA的枯草芽孢杆菌菌株的培养上清。图3为回收的IA的SDS-PAGE电泳图。泳道1，蛋白marker；泳道2，包含pNWP43N-BsCel5-intein-StIA的枯草芽孢杆菌菌株的培养上清；泳道3，使用RAC回收的BsCel5-intein-StIA融合蛋白；泳道4：内含肽断裂后回收的StIA。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本专利技术的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1：pNWP43N-StIA和pNWP43N-BsCel5-StIA重组质粒的构建编码异淀粉酶(GenBank登录号：BAB65940.1)的DNA片段使用下列引物从硫化叶菌的基因组扩增：pNWP3N-StIA-IF：5′-GTAACACATGCCTCAGCTGCAATGGTGTTCAGCCATAAAGATCGTC-3′pNWP43N-StIA-IR：...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌融合表达系统，特征在于包含能够编码至少以下元件的DNA序列，所述元件包括信号肽、糖苷水解酶或其部分和外源蛋白，并且依上述顺序排列融合在一个开放读码框内。/n

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌融合表达系统，特征在于包含能够编码至少以下元件的DNA序列，所述元件包括信号肽、糖苷水解酶或其部分和外源蛋白，并且依上述顺序排列融合在一个开放读码框内。


2.权利要求1的融合表达系统，其中所述糖苷水解酶包含如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。


3.权利要求1的融合表达系统，其中所述糖苷水解酶是一种同系物，其与含有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的糖苷水解酶具有70％的氨基酸序列相似性。


4.权利要求1的融合表达系统，其中糖苷水解酶或其部分和外源蛋白之间具有接头序列、用于蛋白酶剪切的靶位点或内含肽插入。


5.使用权利要求1的融合表达系统分泌生产外源蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)构建合适的枯草芽孢杆菌细胞，其包含能...

【专利技术属性】
技术研发人员：游淳，石婷，刘珊，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12