2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株、构建方法与应用技术

本发明专利技术公开2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2‑ΔNsub，所述突变株SS2‑ΔNsub是将2型猪链球菌的生物被膜相关基因Nsub从第646750位至第649725位之间的编码基因敲除后获得的，所述被膜基因Nsub的全部编码序列为SEQIDNO.1。本发明专利技术突变株不仅使菌株的毒力大大降低，不含有抗性筛选标记，实验验证也具有非常好的遗传的稳定性，不存在毒力返强的风险，从而保证了该菌株的安全性。同时Nsub敲除突变株SS2‑ΔNsub的构建方法简单高效，为进一步研究2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub的功能及其致病机制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株、构建方法与应用
本专利技术属于基因工程
，尤其是一种2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株、构建方法与应用。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis)是一种世界范围内流行的人畜共患病病原菌，不仅可致猪脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎及心内膜炎等，而且还可感染人并导致多种严重的疾病。猪链球菌血清型众多，其中2型猪链球菌是猪链球菌35个血清型中分布最广、致病能力最强的一种致病菌，可感染猪和人类引起脑膜炎、关节炎、败血症、肺炎乃至急性死亡，给公共卫生安全带来了严重威胁。而猪链球菌形成的生物被膜可能通过宿主免疫系统和抗生素引起持续感染，细菌生物膜在持续性感染中起着重要作用，生物被膜在猪链球菌感染的发病机制和持续性中起着关键作用，这些感染很少可以通过抗菌治疗来根除。但是，目前关于S.suis感染宿主并致病的分子机制尚不明确。因此，进一步探索研究新的致病相关基因的功能及其在与宿主相互作用中发挥的作用，对筛选潜在的疫苗候选分子、揭示其发生发展的分子机制，进一步提高我国预防和治疗水平具有重要意义。对于猪链球菌毒力因子的研究一直是一个热点，在2型猪链球菌中，已发现的毒力因子主要包括溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、纤维蛋白原结合蛋白(FBP)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等，由于毒力因子的多样性和复杂性，仅靠毒力因子还不足以解释导致猪链球菌病暴发的原因。在SS2毒力因子的研究过程中，国内外许多学者通过构建某一基因的敲除突变株，并与野生株比较毒力变化，来揭示该基因在SS2致病中的作用，也为新型疫苗的研发奠定了理论基础。疫苗是一种安全有效的病原菌防控手段，特别是减毒活疫苗和亚单位疫苗。基因敲除又称基因打靶，是指基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术，又称为同源重组技术。该技术的基本原理是通过事先设计好的目标基因上下游的同源片段，和基因组发生同源交换，从而将靶基因片段置换下来，以实现敲除目的基因的目的。Nsub蛋白是在多种革兰氏阳性菌中发现的由Nsub基因编码的细胞表面蛋白，近年来在猪链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、变形链球菌、结核链球菌、阿莱特葡萄球菌中等均发现该蛋白。本申请人通过对本研究室分离鉴定的2型猪链球菌JS14菌株的基因组分析，发现一个Nsub蛋白编码基因，据报道细胞表面蛋白Nsub与猪链球菌生物被膜的形成有关。作为细胞表面蛋白，可能参与一些分子功能，包括转运体活性、核苷酸结合、运动活性、蛋白质结合和催化活性，我们预测这些表面蛋白可能会影响细菌细胞间的相互作用。然而，Nsub的分子功能和生物学过程目前还不清楚。通过检测，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株及其构建方法与应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub，所述突变株SS2-ΔNsub是将2型猪链球菌的生物被膜相关基因Nsub从第646750位至第649725位之间的编码基因敲除后获得的，所述被膜基因Nsub的全部编码序列为SEQIDNO.1。而且，所述2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub利用pSET4s质粒的温敏性、壮观霉素抗性及同源重组原理筛选获得。而且，所述2型猪链球菌为2型猪链球菌JS14菌株。如上所述的2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub的构建方法，步骤如下：⑴构建含有同源重组片段的重组质粒pSET4s-Nsub，步骤如下：①以2型猪链球菌基因组Nsub编码基因的上游DNA序列为模板，设计特异性引物L1和L2，扩增Nsub基因上游同源臂L，以2型猪链球菌基因组Nsub编码基因的下游DNA序列为模板，设计特异性引物R1和R2，扩增Nsub基因下游同源臂R，分别纯化回收得到上游同源臂产物L和下游同源臂产物R；L1：SEQIDNO.2：GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTATGAACAAAATTCTAAAAAGTGL2：SEQIDNO.3：GTTTGAAAAAAATTTTTTAGTGTAAATTAGCAGCTCCAACTTCTR1：SEQIDNO.4：AGAAGTTGGAGCTGCTAATTTACACTAAAAAATTTTTTTCAAACR2：SEQIDNO.5：GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTCATCCATCAGACTCCTCCT②将温敏型自杀性质粒PSET4s用EcoRI和HindIII酶切后切胶回收；③将纯化回收得到上游同源臂产物L和下游同源臂产物R与纯化回收得到质粒PSET4s加入等体积的DNA片段的克隆试剂，混合均匀后50℃反应15min；④吸取反应产物至已经融化好的Mach1-T1感受态细胞中，混匀后冰10min，冰浴结束后，放置42℃水浴锅中，热激120s，取出继续冰浴3min；冰浴结束后加入不含抗性的LB液体培养基，反应产物：不含抗性的LB液体培养基的体积比为1：20，置于37℃恒温震荡培养箱中220rpm培养30min；⑤取出37℃恒温震荡培养箱中的产物，3000rpm离心4min，于超净台中取出上清弃之，将剩余液体吹打混匀，均匀涂在平板上，将其置于37℃培养箱中培养过夜；⑥挑取平板中的单菌落扩大培养，12h后抽提质粒并送测序部进行测序；⑦将测序部发回的测序结果与目标序列进行比对，筛选出正确的克隆进行保存，获得重组质粒pSET4s-Nsub；⑵将获得的重组质粒pSET4s-Nsub电转化入2型猪链球菌强毒株内，通过温度、壮观霉素及同源重组原理筛选获得2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub。而且，所述步骤⑴③中DNA片段的克隆试剂为无缝克隆重组Mix2×SeamlessCloningMix(该试剂是BM无缝克隆试剂盒中的试剂，用于DNA片段的克隆。)。而且，所述步骤⑴⑥中挑取平板中的单菌落于装有液体培养基的试管中扩大培养。而且，所述步骤⑵的具体步骤如下：①复苏2型猪链球菌菌株，次日按照1:100转接于新鲜培养基中，37℃培养至OD600值为0.6±0.3，冰浴15-30min，取菌液，4000r/min离心5min，4℃，弃上清；加预冷的ddH2O重悬菌体，菌液：预冷的ddH2O的体积比为1：1，4000r/min离心5min，4℃，弃上清；重复上述步骤用预冷的ddH2O重悬菌体，4000r/min离心5min，4℃，弃上清；用ddH2O重悬菌体，加入重组质粒，转到预冷的2mm电转杯中，调整电穿孔仪参数：2.25kv，200Ω，25uF，电击；将电击产物迅速转移到新鲜培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述突变株SS2-ΔNsub是将2型猪链球菌的生物被膜相关基因Nsub从第646750位至第649725位之间的编码基因敲除后获得的，所述被膜基因Nsub的全部编码序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述突变株SS2-ΔNsub是将2型猪链球菌的生物被膜相关基因Nsub从第646750位至第649725位之间的编码基因敲除后获得的，所述被膜基因Nsub的全部编码序列为SEQIDNO.1。


2.根据权利要求1所述的2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub利用pSET4s质粒的温敏性、壮观霉素抗性及同源重组原理筛选获得。


3.根据权利要求1或2所述的2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述2型猪链球菌为2型猪链球菌JS14菌株。


4.如权利要求1至3任一项所述的2型猪链球菌生物被膜相关基因Nsub敲除突变株SS2-ΔNsub的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴构建含有同源重组片段的重组质粒pSET4s-Nsub，步骤如下：
①以2型猪链球菌基因组Nsub编码基因的上游DNA序列为模板，设计特异性引物L1和L2，扩增Nsub基因上游同源臂L，以2型猪链球菌基因组Nsub编码基因的下游DNA序列为模板，设计特异性引物R1和R2，扩增Nsub基因下游同源臂R，分别纯化回收得到上游同源臂产物L和下游同源臂产物R；
L1：SEQIDNO.2；
L2：SEQIDNO.3；
R1：SEQIDNO.4；
R2：SEQIDNO.5；
②将温敏型自杀性质粒PSET4s用EcoRI和HindIII酶切后切胶回收；
③将纯化回收得到上游同源臂产物L和下游同源臂产物R与纯化回收得到质粒PSET4s加入等体积的DNA片段的克隆试剂，混合均匀后50℃反应15min；
④吸取反应产物至已经融化好的Mach1-T1感受态细胞中，混匀后冰10min，冰浴结束后，放置42℃水浴锅中，热激120s，取出继续冰浴3min；冰浴结束后加入不含抗性的LB液体培养基，反应产物：不含抗性的LB液体培养基的体积比为1：20，置于37℃恒温震荡培养箱中220rpm培养30min；
⑤取出37℃恒温震荡培养箱中的产物，3000rpm离心4min，于超净台中取出上清弃之，将剩余液体吹打混匀，均匀涂在平板上，将其置于37℃培养箱中培养过夜；
⑥挑取平板中的单菌落扩大培养，12h后抽提质粒并送测序部进行测序；
⑦将测序部发回的测序结果与目标序列进行比对，筛选出正确的克隆进行保存，获得重组质粒pSET4s-Nsub；
⑵将获得的重组质粒pSET4s-Nsub电转化入2型猪链球菌强毒株内，通过温度、壮观霉素及同源重组原理筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑞利，张欣，于恩远，李留安，潘晨浩，金天明，马吉飞，于晓雪，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12