一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高谷氨酸棒杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术成功实现了敲除α‑酮戊二酸抑制蛋白和琥珀酸脱氢酶以及过表达5‑氨基乙酰丙酸合成酶的重组谷氨酸棒杆菌的构建。采用5‑L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032/△odhI△sdhA/pXMJ19‑hemA发酵84h，在加终浓度4g/L甘氨酸的情况下在48h合成了25.05g/L的5‑ALA，生产率为0.52g/L/h，此时糖酸转化率达到16.79％。实现了5‑氨基乙酰丙酸的高产，获得了以葡萄糖为碳源开始一步发酵的截止目前的最高产量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法
本专利技术涉及一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程

技术介绍
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinicacid，5-ALA)是很多四吡咯化合物例如血红素、叶绿素、维生素B12前体的一种非蛋白原氨基酸。在诸多领域尤其医药和农业方面有着非常重要的作用。在医药行业，5-ALA目前主要被应用于各种癌症的光动力诊断治疗和多种疾病的肿瘤定位。在农业领域，它被用作一种可生物降解的除草剂、杀虫剂或对作物、动物和人类无毒的生长调节剂。5-ALA生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。由于化学合成法产量低，又存在严重的环境污染问题，因而不适合大规模的生产。因此，目前国内外主要采用微生物菌株发酵生产5-ALA。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是我国一种短杆或小棒状、无芽孢、无内毒素的革兰氏阳性菌株，在国内的氨基酸生产中被广泛应用。杨等运用分批补料发酵和两阶段发酵的策略，以重组C.glutamicumC4途径最终产生14.7g/L5-ALA，生产率为0.92g/L/h，这是迄今为止报道的通过C.glutamicum以葡萄糖为原料合成5-ALA的最高产率(具体参见文献YangP,LiuW,ChengX,etal.Anewstrategyforproductionof5-aminolevulinicAcidinrecombinantCorynebacteriumglutamicumwithhighyield.ApplEnvironMicrobiol,2016,82(9):2709-2717.)，但是，该方法的缺点为需要两阶段发酵，并且培养基成分较复杂，甘氨酸的初始浓度较高，还需要添加琥珀酸。由于目前发酵生产5-ALA的水平普遍较低，导致5-氨基乙酰丙酸的价格比较的昂贵，并且目前生产5-ALA的产能并不能满足国内需求；因此，提高5-ALA的发酵生产水平非常重要。
技术实现思路
技术问题本专利技术要解决的技术问题是提高5-氨基乙酰丙酸的产量，同时，提高5-ALA的发酵生产水平。技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术构建了一种重组谷氨酸棒杆菌，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，敲除了α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA，并且过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌是以pXMJ19质粒或pK18mobsacB质粒为表达载体，过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。在本专利技术的一种实施方式中，所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述琥珀酸脱氢酶sdhA的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述琥珀酸脱氢酶sdhA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术还提供了一种构建重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建宿主细胞：通过敲除谷氨酸棒杆菌C.glutamicum13032中编码α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的基因odhI和编码琥珀酸脱氢酶sdhA的基因sdhA，构建宿主细胞C.glutamicum13032△odhI△sdhA；(2)构建重组质粒：将氨基酸序列如SEQIDNO.3所示5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA与穿梭型载体pXMJ19连接，得到重组质粒pXMJ19-hemA；(3)将重组质粒pXMJ19-hemA电转入重组谷氨酸棒杆菌株C.glutamicum13032△odhI△sdhA，构建得到重组菌C.glutamicum13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，采用同源重组的方法敲除α-酮戊二酸抑制蛋白odhI：以pK18mobsacB质粒作为载体，设计两段同源臂，将odhI基因与载体进行连接，完成第一次同源重组后，采用蔗糖平板进行筛选，完成第二次交换，得到odhI敲除成功的重组谷氨酸棒杆菌株，命名为谷氨酸棒杆菌C1；在C1菌株中按照相同的方法继续敲除基因sdhA，得到菌株C.glutamicum13032△odhI△sdhA。本专利技术还提供了一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法为，应用上述重组谷氨酸棒杆菌，以葡萄糖为原料，发酵生产5-氨基乙酰丙酸。在本专利技术的一种实施方式中，将上述重组谷氨酸棒杆菌添加至种子培养基中，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，生产5-氨基乙酰丙酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子液按8～12％的比例接种至发酵培养基中，进行发酵培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：葡萄糖125-140g/L，硫酸铵20-25g/L，磷酸二氢钾2-3g/L，七水合硫酸镁0.5-1g/L，玉米浆30-50g/L，七水合硫酸亚铁0.02-0.05g/L，一水合硫酸锰0.02-0.05g/L，尿素1-2g/L。在本专利技术的一种实施方式中，将上述发酵培养基用体积分数为50％的氨水调节其pH至6.5，在121℃下高温灭菌20min，葡萄糖分消。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含氯霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于种子培养基中，30℃培养20-22h。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基组成：葡萄糖140-150g/L，三水合磷酸氢二钾1-2g/L，硫酸镁0.6-1.0g/L，玉米浆5-8g/L，七水合硫酸亚铁0.002-0.005g/L，一水合硫酸锰0.002-0.005g/L，尿素7.0-8.0；去离子水配置，pH7.0。在本专利技术的一种实施方式中，将重组谷氨酸棒杆菌添加至种子培养基中，在28-32℃、180-200rpm条件下培养20-24h，得到种子液。在本专利技术的一种实施方式中，将种子液接种至发酵培养基中，在28-32℃、200-220rpm条件下培养84-96h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将重组谷氨酸棒杆菌添加至含有种子培养基的5-L发酵罐中，得到种子液，将得到的种子液按照10％(v/v)的比例接种至含有发酵培养基的5-L发酵罐中，在30℃条件下进行发酵培养，制备5-氨基乙酰丙酸。在本专利技术的一种实施方式中，发酵过程中，温度由发酵罐自动控制，pH通过补加体积分数为25％氨水维持稳定。本专利技术还提供了上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，敲除了α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA，并且过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，敲除了α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA，并且过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。


2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pK18mobsacB质粒或pXMJ19质粒为表达载体，过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。


3.如权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述琥珀酸脱氢酶sdhA的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.构建权利要求1-3任一所述重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建宿主细胞：敲除谷氨酸棒杆菌13032中编码α-酮戊二酸抑制蛋白基因odhI和编码琥珀酸脱氢酶的基因sdhA，构建宿主细胞C.glutamicum13032△odhI△sdhA；
(2)构建重组质粒：将氨基酸序列如SEQIDNO.3所示5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA与pXMJ19质粒连接，得到重组质粒pXMJ19-hemA；
(3)将重组质粒pXMJ19-hemA转入宿主细胞C.gl...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，王丽君，杨套伟，徐美娟，张显，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32