一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用技术

本发明专利技术公开一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。所述基因工程菌株的构建包括以下步骤：A：将自杀质粒p19‑Mn_hal电转化导入Mn‑egtABCDE‑hisG菌株感受态，利用同源臂引物进行PCR扩增筛选，获得MnΔhal‑egtABCDE‑hisG菌株；B：将整合型质粒pMV306‑Mn_hisC‑Mn_allB1电转化导入MnΔhal‑egtABCDE‑hisG感受态，平板筛选，验证，即得。本发明专利技术通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造，构建的基因工程菌株生产麦角硫因的能力相对野生型菌株提高18倍，相对出发菌株提高4.1倍，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用
本专利技术涉及生物合成应用领域，具体涉及一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。技术背景麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，又名巯基组氨酸甜菜碱(Thiolhistidine-betaine)，学名2-巯基组氨酸三甲基内盐，是已知唯一的天然2-硫代咪唑氨基酸。EGT可由蕈类真菌、粗糙脉孢菌及蓝细菌等生物合成，但尚未发现任何动物或植物具有合成EGT的能力。EGT具有细胞氧化还原，信号转导及生物能量稳态的功能，被认为是延长健康、延缓衰老的重要因素，适当补充可显著降低罹患中老年慢性疾病和早衰的风险。异养型的人体主要依赖从日饮食中摄取麦角硫因，由转运蛋白基因SLC22A4编码合成的OCTN1蛋白介导了人体细胞对EGT的摄取。EGT主要可经化学合成、食用真菌或菌丝体深层发酵提取法获取。然而，化学合成法收率低、污染重、成本高，食用真菌的发酵产量低，生产成本也较高，这在一定程度上限制了EGT的推广应用。在众多食用菌中，美味牛肝菌(Boletusedulis)的产量相对较高，每克干重含量约为7.27mg(KalarasMD,RichieJP,CalcagnottoA,etal.Mushrooms:Arichsourceoftheantioxidantsergothioneineandglutathione.FoodChemistry,2017,233,429–433.)。由于粗糙脉孢菌(HuW,SongH,HerAS,etal.BioinformaticandbiochemicalcharacterizationsofC-SbondformationandcleavageenzymesinthefungusNeurosporacrassaergothioneinebiosyntheticpathway.OrganicLetters,2014,16(20):5382-5385.)、蓝细菌(PfeifferC,BauerT,SurekB,etal.Cyanobacteriaproducehighlevelsofergothioneine.FoodChemistry,2011,129(4):1766–1769.)、耻垢分枝杆菌(SeebeckFP.InvitroreconstitutionofMycobacterialergothioneinebiosynthesis.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2010,132(19):6632-6633.)等微生物均具有合成EGT的能力，因此，利用遗传改造来开发高产EGT的基因工程菌株，是一个具有良好应用前景的技术方向。EGT的天然合成途径大致可分为两类，一种由EgtABCDE基因簇编码的EgtD，EgtB，EgtA，EgtC和EgtE等5个酶催化的合成途径；另一种是仅需Egt1，Egt2两个酶催化的连续合成途径。通过基因强化参与EGT合成的关键基因表达，可获得生产能力显著提升的EGT工程菌株。利用模式微生物高密度发酵，异源表达EGT合成所需的关键酶基因，可获得具有异源生产EGT能力的基因工程菌株。通过在米曲霉(Aspergillusoryzae)中强化表达粗糙脉孢菌来源的egt1和egt2基因，米曲霉宿主的EGT产量被提升至231mg/L的水平(TakusagawaS,SatohY,OhtsuI,etal.ErgothioneineproductionwithAspergillusoryzae.Bioence,Biotechnology,andBiochemistry,2018,83(1):1-4.)。利用酿酒酵母，通过异源表达麦角菌(Clavicepspurpurea)、耻垢分枝杆菌等多个来源的EGT合成酶基因，在1L生物反应器流加分批发酵的条件下，经84h培养获得了0.598g/L的麦角硫因产量(HoekSAVD,DarbaniB,ZugajKE,etal.EngineeringtheyeastSaccharomycescerevisiaefortheproductionofL-(+)-ergothioneine.FrontiersinBioengineeringandBiotechnology,2019,7:262.)。截止目前，文献报道的EGT最高产量是利用耻垢分枝杆菌来源的egtABCDE基因簇，在大肠杆菌中异源表达，同时，通过流加EGT合成的三种氨基酸前体(L-半胱氨酸，L-组氨酸，L-甲硫氨酸)，优化发酵条件，经过216h的发酵，在3L的发酵罐培养条件下获得1.31g/L的麦角硫因产量(TanakaN,KawanoY,SatohY,etal.Gram-scalefermentativeproductionofergothioneinedrivenbyoverproductionofcysteineinEscherichiacoli.ScientificReports,2019,9(1):1895.)。最近，上述研究组利用甲基杆菌属来源的egtB基因，替换导入大肠杆菌工程菌株，虽然在摇瓶水平获得了0.657g/L的EGT产量，但遗憾的是，该研究却遭遇了重大挫折，在上罐放大测试中，工程菌出现了明显的生长抑制和提前死亡现象，产量并没有出现明显提升(KamideT,TakusagawaS,TanakaN,etal.HighproductionofergothioneineinEscherichiacoliusingthesulfoxidesynthasefromMethylobacteriumstrains.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2020,68(23):6390–16394.)。上述工作提示利用异源宿主合成EGT，由于菌株本身并不生产EGT，以及过多外源基因的引入等原因，工程菌株难以承受高浓度的产物浓度而出现生长抑制和裂解死亡，从而使得发酵放大难以实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用，从而解决现有技术缺乏高产麦角硫因的基因工程菌的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：根据本专利技术的第一方面，提供一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：A：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及B：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：/nA：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及/nB：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR扩增验证，如能扩增出1000bp左右的阳性条带，所对应的菌株为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，即为一种可用于生产麦角硫因的基因工程菌株。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：
A：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及
B：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR扩增验证，如能扩增出1000bp左右的阳性条带，所对应的菌株为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，即为一种可用于生产麦角硫因的基因工程菌株。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒p19-Mn_hal的构建包括以下步骤：
A1：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR分别扩增上、下游同源臂序列，获得上、下游同源臂纯化产物；
A2：p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂纯化产物利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂纯化产物利用EcoRI和BamHI进行酶切，T4酶连接，获得重组质粒p2NIL-Mn_hal；
A3：将pGOAL19质粒产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切，T4酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，扩大培养、抽提获得自杀质粒p19-Mn_hal的纯化产物，电转，涂布蔗糖致死平板，筛选正确的双交换突变菌株，即可获得自杀质粒p19-Mn_hal。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，Mn_hal基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。


4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR的核苷酸序列如SEQIDNo:2-5所示。


5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述整合型质...

【专利技术属性】
技术研发人员：王风清，谢智勇，魏东芝，克洁，陶欣艺，赵明，熊亮斌，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31