无菌免疫原性非-致瘤性肿瘤细胞组合物和方法技术

本发明专利技术涉及除去细胞聚集物中的生物负荷从而得到用于生产疫苗的、仍是活的及免疫原性的细胞的方法。本发明专利技术还涉及一种引发免疫应答从而防止转移瘤复发的方法，包括制备并给予一种来源于实体肿瘤的无菌疫苗。所述疫苗是通过切除癌症患者的实体肿瘤、用酶消化肿瘤细胞从而得到解离细胞、辐射解离细胞使细胞不会致瘤、并将细胞灭菌而制备的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及生物学细胞灭菌方法及所得的无菌细胞产物；更具体而言，但不作为限制，还涉及癌症疫苗及用于制备无菌免疫原性且活的、但不会致瘤的肿瘤细胞组合物的方法。
技术介绍
很难使用于预防和治疗目的的生物细胞组合物灭菌是因为细胞的化学、物理、或生理性质可能由于细胞周围环境的改变而被明显改变。例如，已知使用环氧乙烷进行的气体灭菌有毒而且致癌。用约1-3MRads(兆拉德)辐射虽然足以杀死微生物，但会改变蛋白、DNA、RNA等的结构，且或者生物学改变细胞预期的免疫原性或其它生物学功能或者使细胞完全灭活。当重要的是所运用的任何化学或物理方法不仅要获得高水平的无菌，而且细胞的代谢和免疫原性基本不会降低时，这些困难加剧。美国专利US 5,484,596(“’596专利”)，名称为“有效的特异性免疫疗法”，涉及一种治疗患有可切除实体肿瘤的人结肠癌患者，从而抑制转移瘤复发和形成的方法。所述方法包括手术除去人类癌症患者的结肠肿瘤组织，处理肿瘤组织以得到肿瘤细胞，(用20,000拉德)辐射肿瘤细胞至活的但不会致瘤，制备含有活的非-致瘤性肿瘤细胞的疫苗，并在癌症患者的免疫系统已经从手术恢复后，真皮内注射该疫苗。依靠大肠内结肠肿瘤的来源，通过’596专利方法生产的癌症疫苗不是无菌的。虽然按照该专利制备的疫苗产品(OncoVAX)已经给予过几百名人类患者，但是管理机构现在要求这种疫苗产品必需是无菌的。为了获得免疫原性细胞制剂，肿瘤细胞必须是活的及代谢活性的。因此，使细胞无菌的任何处理都必须不会过度危害功效所需的细胞的重要生物学性质。我们所需要的是一种使细胞制剂无菌，同时维持存活力及免疫原性的方法。优选，这种灭菌方法可很容易被结合到现有的产品制造方法中。本专利技术的目的是获得安全、无菌的肿瘤细胞组合物，而不会对肿瘤细胞的免疫原性造成重大改变。这些目的并非必需兼容。例如，灭菌可灭活微生物感染但也会大量灭活哺乳动物细胞；消毒剂可杀死微生物但也会杀死哺乳动物细胞；辐射可使微生物感染灭活但也会大大改变哺乳动物细胞的免疫原性和其它性质。因此，希望提供一种获得无菌非-致瘤性肿瘤细胞组合物的方法，其基本上不会干扰细胞的重要代谢和免疫原性。专利技术概述本专利技术提供一种用于除去和灭活肿瘤细胞中生物负荷的十分有效的化学和物理方法的联合，从而获得用于生产治疗和预防性产品的、仍是活的和免疫原性的无菌细胞组合物。这种灭菌处理方法被认为可用于各种细胞类型；然而，它被认为特别适用于将实体肿瘤组织灭菌，用于制备癌症疫苗，包括，例如，’596专利的自体结肠癌疫苗。本专利技术还涉及通过给予一种源于实体肿瘤的无菌疫苗而治疗癌症和防止转移瘤复发的方法，所述实体肿瘤包括，但不限制于，结肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、和肉瘤，包括骨肉瘤。在其中一个实施方案中，本专利技术提供一种完整的多步方法，它以原位肿瘤开始，并产生无菌的肿瘤细胞疫苗，该疫苗被证实没有微生物生长。根据本专利技术另一实施方案，用含有生理盐水和洗涤剂的洗涤溶液有力洗涤原位结肠肿瘤。有力洗涤可通过将无菌端口无菌装在含有洗涤溶液的袋上，并将这种溶液“喷”在肿瘤和周围组织上而获得。适宜的洗涤剂包括，例如，Triton X-100、NP40和Tween 80。然后切除该肿瘤，并在可控条件下运送到用于制备疫苗的设备上。然后解剖切除的肿瘤，用化学消毒剂处理，并在消化前破碎，释放单个肿瘤细胞。对消毒剂的浓度和处理的持续时间进行选择可提高抗微生物的活性，同时使细胞毒性减到最小。适宜的消毒剂包括，但不限制于，Clorpactin(氧氯苯磺酸钠)(United-Guardian，Inc.)、次氯酸钠、和Oxygene(稳定的二氧化氯)(Oxyfresh Worldwide，Inc.)。消毒后，使肿瘤破碎并利用解离酶消化，优选在有抗生素和一种或多种抗-霉菌剂存在的条件下进行。适宜解离酶的例子包括胶原酶和胰蛋白酶。解离过程中所用的抗生素和抗-霉菌剂包括氨基苷类抗生素(如庆大霉素)、β-内酰胺沙纳霉素类抗生素(如Primaxin(伊米配能)(Merck & Co.，Inc.))、喹诺酮类抗生素(如Levaquin(左氟沙星)(Ortho-McNeil))、和抗-霉菌剂(如两性霉素B)。解离后，可以约-1℃/分钟的受控速率冷冻至约-80℃而冷冻保存混悬的肿瘤细胞。然后对肿瘤细胞，优选仍然冷冻的肿瘤细胞进行辐射，辐射的剂量足以灭活微生物和致瘤性，而不会不利地影响细胞的存活力、代谢活性、和免疫原性。辐射剂量是约100,000-200,000拉德γ射线；优选约150,000-200,000拉德；且更优选约190,000-200,000拉德。辐射细胞在冷冻状态下维持，直到在给予患者前融化。通过真皮内注射，优选以约107个活的肿瘤细胞/剂给予患者癌症疫苗形式的融化无菌细胞，从而引发免疫应答并防止转移瘤复发。通过台盼蓝排斥法测量，所述剂量所含的肿瘤细胞通常具有至少80％的存活力。疫苗可以多个剂量给予患者，包括每周一次最少3周。剂量可与佐剂或免疫刺激剂在生理盐水中结合，以便进一步加强免疫应答。适宜佐剂和免疫刺激剂的例子包括BCG(卡介苗(Organon，Inc.))、小棒杆菌(GlaxoSmithKline)、“辅助”抗原，如KLH(匙孔血蓝蛋白(Intracel Corp.))、和淋巴因子-细胞因子，如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(Leukine))(Schering-Plough))和干扰素(Avonex(Biogen，Inc.))。按照特别优选的实施方案，本专利技术的灭菌方法包括(1)每次用500mL量的无菌生理盐水有力洗涤原位结肠肿瘤和周围组织4次，其中至少一次生理盐水洗涤含有1％Triton X-100；(2)在0-6℃的温度下运送肿瘤，其中手术切除与解离过程开始之间间隔至少48小时；(3)在破碎前，用0.4％ Clorpactin处理肿瘤碎片2分钟；(4)在有庆大霉素、Primaxin、Levaquin、和两性霉素B存在的条件下解离肿瘤；并(5)用200,000拉德辐射解离的细胞，同时冷冻。生物等价研究是使用所得的无菌肿瘤细胞开始的。阳性免疫原性的标准是第三次注射的延迟皮肤过敏(“DCH”)反应≥5mm。迄今为止，已经治疗过12名患者。所有患者都具有超过阳性免疫原性反应标准的DCH反应(平均14.6×13.4mm)。根据癌症的诊断分期，患者在第一次注射后5-9个月接受第4次治疗。接受第4次治疗的6名患者中的5名具有15.1×15.1mm的平均DCH反应。这些反应是对无菌肿瘤细胞的长期免疫性以及因此对结肠直肠癌复发的免疫性的发展的指示。根据连同附图一起提供的下列详细描述可更容易地理解本专利技术的这些和其它优点及特征。当在下面的实施例中讨论结肠肿瘤和自体结肠癌疫苗制剂时，本专利技术的教导可应用于将要经历灭菌并仍然保持存活力、代谢活性、非-致瘤性和免疫原性的任何实体肿瘤细胞。附图简述附图说明图1证实在用于研究OncoVAX的实验模型中试验的、按照本专利技术制备的疫苗细胞的免疫原性功效，并与通过原始非-无菌OncoVAX方法制备的疫苗细胞的功效进行了比较。正如所见到的那样，改进的灭菌方法对功效没有消极影响。如实施例6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于引发免疫应答从而防止转移瘤复发的方法，包括：切除癌症患者的实体肿瘤组织，　处理肿瘤组织以减少内源性生物负荷，用酶消化肿瘤组织从而得到解离的肿瘤细胞，将辐射剂量应用于所述解离肿瘤细胞从而使所述肿瘤细胞不 会致瘤且无菌，以足以引发免疫应答从而防止转移瘤复发的剂量和方式给予所述患者所述无菌非致瘤性细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MV哈斯佩尔，N波马托，MG小汉纳，
申请(专利权)人：英特拉舍尔资源有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]